中藥復(fù)方益糖康對(duì)DN模型大鼠腎臟組織中AGEs、RAGEs影響的實(shí)驗(yàn)研究

張文順，石巖

（1. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 研究生學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110847；2. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽(yáng) 110847）

中藥復(fù)方益糖康對(duì)DN模型大鼠腎臟組織中AGEs、RAGEs影響的實(shí)驗(yàn)研究

張文順1，石巖2Δ

（1. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 研究生學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110847；2. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽(yáng) 110847）

目的觀察中藥復(fù)方益糖康對(duì)糖尿病腎病大鼠腎皮質(zhì)中晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glyclation end-products，AGEs）及其受體的影響，探討其對(duì)糖尿病腎病的防治作用機(jī)制。方法采用鏈脲佐菌素（strepotozotocin，STZ）誘導(dǎo)大鼠糖尿病模型，觀察8周時(shí)腎臟組織AGEs、RAGE mRNA及蛋白表達(dá)的變化，以及經(jīng)中藥復(fù)方益糖康干預(yù)后的變化。結(jié)果糖尿病大鼠8周時(shí)，模型大鼠腎臟組織中的AGEs含量顯著高于空白組（P＜0．01），而中藥預(yù)防組、中藥低劑量組、中藥高劑量組、西藥組大鼠腎臟組織中AGEs含量較模型組顯著下降（P＜0．01）；糖尿病腎病模型組大鼠腎臟組織中糖基化終末產(chǎn)物受體（receptor of advanced glyclation end-products，RAGE）mRNA表達(dá)水平較空白組顯著升高（P＜0．01），而中藥預(yù)防組、中藥低劑量組、中藥高劑量組、西藥組大鼠腎臟組織中RAGE mRNA表達(dá)水平較模型組顯著下調(diào)（P＜0．01）。結(jié)論中藥復(fù)方益糖康對(duì)糖尿病大鼠腎功能的保護(hù)作用，與其抑制AGEs/RAGE的激活有關(guān)。

糖尿病腎??；晚期糖基化終末產(chǎn)物；糖基化終末產(chǎn)物受體；益糖康

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 AGEs含量檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司。兔抗大鼠RAGE 多克隆抗體購(gòu)自Cell Signaling。兔抗大鼠GAPDH抗體購(gòu)自Santa Cruz，HRP標(biāo)記羊抗兔IgG抗體購(gòu)自Abcam。RT-PCR試劑盒購(gòu)自北京全式金生物科技有限公司。引物由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司代為合成。

主要實(shí)驗(yàn)儀器：VERITI型PCR儀（BIO-RAD），電泳儀（EPS 300，北京六一），凝膠成像分析系統(tǒng)（Tanon-4200 SF，上海天能）。

1.2 糖尿病腎病大鼠模型的構(gòu)建及分組 SPF級(jí)SD大鼠

70只，體重200±20 g。采用隨機(jī)數(shù)字法將70只大鼠隨機(jī)分為正常組和造模組。除正常組外，其余各組采用高脂高糖飼料聯(lián)合小劑量STZ（42 mg/kg，bw）的方法復(fù)制糖尿病大鼠模型，72 h后尾靜脈采血測(cè)血糖，隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L以上者確定為糖尿病大鼠模型模型復(fù)制成功。糖尿病模型成功后按照血糖將造模組大鼠隨機(jī)分為5組，分別為模型組、中藥預(yù)防組、中藥低劑量組、中藥高劑量組、西藥組（予貝那普利）。2周后留取24 h尿，若達(dá)到下列條件則認(rèn)為糖尿病腎病模型成立[6]：①空腹血糖持續(xù)≥16.7 mmol/L；②尿白蛋白排泄率＞20 μg/min；③尿量是正常量的150%。中藥預(yù)防組和中藥低劑量組按照正常成人劑量（g/Kg）的6.3倍給藥，中藥預(yù)防組自糖尿病造模成功開(kāi)始即給藥；中藥高劑量組按照低劑量的3倍給藥；西藥組給藥量按照正常成人給藥量等效換算成年大鼠給藥量，即0.9 mg/（Kg·d）。

1.3 指標(biāo)檢測(cè)

1.3.1 各組大鼠腎臟組織中AGEs含量檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）法檢測(cè)各組大鼠腎臟組織中AGEs含量。取各組大鼠腎臟皮質(zhì)100 mg置于2 mL玻璃勻漿器中，加入1 mL冷的PBS緩沖液，于冰上進(jìn)行勻漿，收集勻漿液于2 mL離心管中，4℃離心機(jī)中，2000 r/min，離心10 min，吸取上清液用于AGEs含量檢測(cè)，檢測(cè)方法嚴(yán)格按照試劑盒中說(shuō)明書(shū)操作步驟進(jìn)行。

1.3.2 各組大鼠腎臟組織中RAGE表達(dá)水平檢測(cè) 采用Western-bloting方法對(duì)各組大鼠腎臟組織中RAGE表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。稱(chēng)取腎臟皮質(zhì)100 mg，按照組織凈重與裂解液1：10的比例加入蛋白提取試劑，并用玻璃勻漿器在冰上進(jìn)行勻漿，勻漿后靜置于冰上20 min，10000 r/min進(jìn)行離心，離心15 min，分離上清液即為總蛋白備用。采用考馬斯亮藍(lán)法對(duì)各組總蛋白進(jìn)行蛋白定量，每孔上樣20 μg總蛋白進(jìn)行電泳，半干轉(zhuǎn)印法將蛋白轉(zhuǎn)至 PVDF 膜，一抗（1∶500）4℃孵育過(guò)夜、二抗（1∶1000）室溫孵育1 h，TBST緩沖液洗膜3次，用吸水紙吸干PVDF膜上的殘液，加ECL發(fā)光液1 mL，置于凝膠成像分析系統(tǒng)中采集圖像，并測(cè)定目的蛋白條帶和內(nèi)參條帶的灰度值，以目的蛋白灰度值/內(nèi)參條帶灰度值比值作為統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，進(jìn)行RAGE表達(dá)水平分析。

1.3.3 各組大鼠腎臟組織中RAGE mRNA表達(dá)水平檢測(cè) 采用RT-P C R方法對(duì)各組大鼠腎臟組織中RAGE mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)：RAGE上游引：5’-GGCCTTCCTCGGCGCAGAC-3’；下游引物：5’-TAGA TGCCCTCATCCTCATGC-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度 260 bp。內(nèi)參β-actin上游引物：5’-CGTAAAGACCTCTATGC CAA-3’；下游引物：5’-AGCCATGCCAAATGTGTCAT-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度349 bp。凝膠成像分析系統(tǒng)采集圖像，并測(cè)定目的基因條帶和內(nèi)參基因條帶的積分光密度值，以目的條帶積分光密度值/內(nèi)參基因積分光密度值的比值作為統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，進(jìn)行RAGE mRNA表達(dá)水平分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 10.0軟件對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，正態(tài)計(jì)量數(shù)據(jù)用“±s”表示，并采用單因素方差分析數(shù)據(jù)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 益糖康對(duì)糖尿病大鼠腎臟組織中AGEs含量影響 糖尿病腎病模型大鼠腎臟組織中的AGEs含量為（763.75±47.34）ng/g 組織，顯著高于空白組（P＜0.01）；與模型組比較，中藥預(yù)防組、中藥低劑量組、中藥高劑量組、西藥組大鼠腎臟組織中AGEs含量均顯著下降（P＜0.01，見(jiàn)表1）。

表1 大鼠腎臟組織中AGEs含量測(cè)定Tab.1 Measurement of AGEs content in rat kidney

*P＜0.01，與空白組比較，compared with blank group；﹟P＜0.01，與模型組比較，compared with model group；△P＜0.01，與西藥組比較，compared with western medicine group。

2.2 益糖康對(duì)糖尿病大鼠腎臟組織中RAGE mRNA及蛋白表達(dá)影響 與空白組比較，DN模型組大鼠腎臟組織中RAGE mRNA表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，中藥預(yù)防組、中藥低劑量組、中藥高劑量組、西藥組大鼠腎臟組織中RAGE mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)（P＜0.01，見(jiàn)圖1、圖2）。

圖1 益糖康對(duì)DN模型大鼠腎臟組織中RAGE mRNA表達(dá)水平影響**P＜0.01，與空白組相比；＃＃P＜0.01，模型組相比；△△P＜0.01，與西藥組相比Fig.1 The effect of Chinese herbal compound Yitangkang extract on renal RAGE mRNA in rats with diabetic nephropathy**P＜0.01，compared with blank group；＃＃P＜0.01，compared with model group；△△P＜0.01，compared with western medicine group

圖2 益糖康對(duì)DN模型大鼠腎臟組織中RAGE mRNA表達(dá)水平的影響M. marker；1. 空白組；2. 模型組；3. 中藥預(yù)防組；4. 中藥低劑量組；5. 中藥高劑量組；6. 西藥組Fig.2 The effect of Chinese herbal compound Yitangkang extract on expression of renal RAGE mRNA in rats with diabetic nephropathyM. marker；1. blank group；2. model group；3. prevent group；4. low dose group；5. high dose group；6. western medicine group

2.3 益糖康對(duì)糖尿病大鼠腎臟組織中RAGE蛋白表達(dá)影響 與空白組比較，DN模型組大鼠腎臟組織中RAGE表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，中藥預(yù)防組、中藥低劑量組、中藥高劑量組、西藥組大鼠腎臟組織中RAGE表達(dá)水平顯著下調(diào)（P＜0.01，見(jiàn)圖 3、圖 4）。

圖3 益糖康對(duì)DN模型大鼠腎臟組織中RAGE蛋白表達(dá)水平影響*P＜0.05，**P＜0.01與空白組相比；＃＃P＜0.01，模型組相比；△△P＜0.01，與西藥組相比Fig.3 The effect of Chinese herbal compound Yitangkang extract on renal RAGE in rats with diabetic nephropathy*P＜0.05，**P＜0.01 compared with blank group；＃＃P＜0.01， compared with model group；△△P＜0.01，compared with western medicine group

圖4 益糖康對(duì)DN模型大鼠腎臟組織中RAGE蛋白表達(dá)水平的影響1. 空白組；2. 模型組；3. 中藥預(yù)防組；4. 中藥低劑量組；5. 中藥高劑量組；6. 西藥組Fig.4 The effect of Chinese herbal compound Yitangkang extract on expression of renal RAGE in rats with diabetic nephropathy1. blank group；2. model group；3. prevent group；4. low dose group；5. high dose group；6. western medicine group

3 討論

DN的病理學(xué)改變包括腎小球肥大、系膜基質(zhì)增生，腎小球基底膜增厚以及最終發(fā)生的腎小球硬化。AGE是糖尿病時(shí)許多組織蛋白質(zhì)、氨基酸、脂質(zhì)或核酸等大分子物質(zhì)的游離氨基在無(wú)酶參與條件下與還原糖的醛基或酮基反應(yīng)而產(chǎn)生的一種穩(wěn)定的化合物。其在糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用，是引起腎臟直接損傷以及通過(guò)RAGE信號(hào)通路而引起腎臟病變的主要物質(zhì)基礎(chǔ)[7]。糖尿病慢性并發(fā)癥的關(guān)鍵因素是由于AGEs及其前體物質(zhì)的蓄積，而腎臟的AGEs及其前體物質(zhì)又直接引起腎小球毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)、功能的改變[8]，參與了DN的發(fā)生發(fā)展。AGEs與細(xì)胞表面的RAGE結(jié)合后，激活RAGE并作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體激活細(xì)胞內(nèi)各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而導(dǎo)致了細(xì)胞功能紊亂，使腎小球產(chǎn)生各種細(xì)胞外基質(zhì)成分，引起腎臟組織增生，導(dǎo)致腎小球的硬化[9-11]。

許惠琴等[12]通過(guò)研究山茱萸環(huán)烯醚萜苷，發(fā)現(xiàn)下調(diào)糖尿病血管病變大鼠腎組織RAGE及TGF-βmRNA的表達(dá)，能夠保護(hù)血管內(nèi)皮，進(jìn)而抗腎小球內(nèi)基質(zhì)的增生及基底膜增厚等作用。馬建等[13-15]通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究，降低腎組織AGES含量，抑制TGF-β 1、RAGEs mRNA、RAGE的表達(dá)，可以改善DN腎臟基質(zhì)增生、系膜區(qū)增寬的病理結(jié)構(gòu)，減輕腎小球硬化，改善腎功能，對(duì)DN起到治療作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病大鼠模型腎皮質(zhì)中均有AGEs生成，尤以模型組最為顯著，且各給藥組對(duì)糖尿病腎病大鼠的腎皮質(zhì)中AGEs含量具有顯著下調(diào)的作用，與模型組比較(P＜0.01)。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)觀察，不同濃度的復(fù)方益糖康可顯著下調(diào)腎臟組織中RAGE的mRNA及RAGE蛋白表達(dá)水平，與模型組比較(P＜0.01)；中藥高劑量組與西藥組比較無(wú)顯著差異，中藥預(yù)防組與西藥組比較(P＜0.01)。說(shuō)明益糖康可能通過(guò)抑制AGEs/RAGE的激活，從而調(diào)節(jié)腎血流量，有保護(hù)血管內(nèi)皮，抗腎小球內(nèi)基質(zhì)增生而起到改善或延緩糖尿病時(shí)腎臟病變的發(fā)生和發(fā)展的作用，這可能是中藥復(fù)方益糖康防治糖尿病腎病的作用機(jī)制之一。

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The effect of Chinese herbal compound Yitangkang extract on expression of renal AGEs and RAGEs in rats with diabetic nephropathy

ZHANG Wen-shun1，SHI Yan2Δ
( 1. Graduate School, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Shenyang 110847, China；2. Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110847, China)

ObjectiveTo observe the effect of Chinese herbal compound Yitangkang on the expressions of advanced glyclation endproducts (AGEs) and the receptor of advanced glyclation end-products mRNA(RAGE-mRNA) in rats with diabetic nephropathy(DN)，and to discuss the mechanism of the formulas in the treatment of DN.MethodsThe rat model of DN were established by intraperitoneal injection of strepotozotocin(STZ). After 8 weeks intervention with medications, the expression of renal RAGEs mRNA was detected by Real-time PCR, renal RAGE by immunohistochemistry, and renal content of AGEs by spectrophotometry.ResultsCompared with normal control group, the expression of renal RAGEs mRNA and RAGEs in diabetic nephropathy rats were increased significantly(P＜0.01). Compared with DN group, the expression of renal RAGEs mRNA and RAGEs in three doses Yitangkang groups and western medicine group were decreased significantly(P＜0.01).ConclusionChinese herbal compound Yitangkang could protect kidney of diabetic nephropathy rats,and the mechanism is related to its loweirng renal expression of RAGEs mRNA, RAGEs and AGEs content.

diabetic nephropathy; advanced glyclation end-products; receptor of advanced glyclation end-products; Yitangkang

R 285．5

A

1005-1678(2014)02-0045-03

隨著糖尿病患病率的不斷增高，糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）發(fā)病率也呈現(xiàn)出逐年上升趨勢(shì)。DN的發(fā)病機(jī)制是多種因子相互作用的過(guò)程，其中晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)在糖尿病腎病的發(fā)生與進(jìn)展中起重要作用[1]，另有報(bào)道AGE與AGE受體蛋白（RAGE）的結(jié)合是通過(guò)促進(jìn)ROS的合成從而導(dǎo)致了成纖維細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡[2]，進(jìn)而引發(fā)糖尿病腎病。中藥復(fù)方“益糖康”是以國(guó)家中藥保護(hù)品種“降糖丹”為基礎(chǔ)研制的，其治療糖尿病經(jīng)過(guò)多年的臨床應(yīng)用，取得了令人滿意的療效[3-5]，故本實(shí)驗(yàn)利用鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型，觀察中藥復(fù)方益糖康對(duì)腎臟組織中AGEs及其受體的調(diào)控，進(jìn)一步探討其對(duì)糖尿病腎病的防治作用機(jī)制。

遼寧省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2011408004）

張文順，男，博士，講師，研究方向：糖尿病臨床與實(shí)驗(yàn)研究，E-mail：wenshunzhang@163.com；石巖，通信作者，男，博士，教授，研究方向：糖尿病臨床與實(shí)驗(yàn)研究，E-mail：shiyan@lnutcm.edu.cn。