文紅波,曹運長,虞佳,王五洲
(南華大學 藥學與生物科學學院,湖南 衡陽 421001)
白楊素對人肝癌HepG2細胞的誘導分化作用
文紅波,曹運長Δ,虞佳,王五洲
(南華大學 藥學與生物科學學院,湖南 衡陽 421001)
目的探討白楊素對人肝癌HepG2細胞的誘導分化和凋亡作用。方法體外培養(yǎng)人肝癌HepG2細胞,用白楊素干預細胞,實驗分組為:空白對照組,溶媒組,全反式維甲酸陽性對照組,白楊素組。臺盼藍計數(shù)法和MTT法檢測藥物對細胞增殖活力的影響;瑞氏-姬姆薩和考馬斯亮藍染色觀察細胞核質(zhì)比和微管微絲排列的變化;放射免疫法檢測細胞甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein,AFP)的分泌量;酶促反應試劑盒檢測細胞中γ-谷胺酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-glutamyltranspeptidase,γ-GT)和堿性磷酸酶(alkaline phosephatase,ALP)的活性;Diamondstone分光光度法測定細胞中酪氨酸α-酮戊二酸轉(zhuǎn)氨酶(tyrosine-α-ketoglutaric acid transaminase,TAT)的合成情況。結(jié)果1~100 μmol/L白楊素和全反式維甲酸處理HepG2細胞48 h后,能顯著抑制肝癌細胞的增殖(P<0.05,P<0.01),2種藥物對細胞增殖的抑制效價相當并存在量效關(guān)系。10 μmol/L藥物作用48 h,細胞的形態(tài)和微管微絲排列由腫瘤細胞向成熟細胞分化;藥物處理24~96 h后,細胞AFP的分泌量和γ-GT的活性明顯降低,ALP和TAT的活性則顯著升高(P<0.05,P<0.01)。結(jié)論白楊素具有抑制人肝癌HepG2細胞增殖并誘導其向正常細胞分化的作用。
白楊素;HepG2細胞;細胞分化;黃酮類化合物
1.1 藥品與試劑 人肝癌HepG2細胞株購自中國典型培養(yǎng)物中心(中國武漢)、全反式維甲酸(RA)、白楊素(ChR)為Sigma公司產(chǎn)品;RPMI-1640培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品;胎牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品;甲胎蛋白(Alphafetoprotein, AFP)檢測試劑盒購自原子高科股份有限公司;堿性磷酸酶(alkaline phosephatase,ALP)和γ-谷胺酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-glutamyltranspeptidase,γ-GT)檢測試劑盒購自南京建成生物工程公司;臺盼藍試劑購自Sigma公司;L-酪氨酸、EDTA、DTT、磷酸吡多醛、α-酮戊二酸,對羥基甲醛、Triton X-100均購自上海生工生物工程有限公司。
1.2 儀器 DXC 800型全自動生化檢測儀(德國Beckman Coulter公司),SN-697型γ放射免疫計數(shù)器(上海核所日環(huán)光電儀器有限公司),2406-2型CO2培養(yǎng)箱(美國Shel-lab公司),IX 51-A 12 PH型倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司),5840 R高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司),天寒TH-86-500-LA型超低溫冰箱(北京天地精儀科技有限公司),SP-752(SP-2000 UV)型紫外可見分光光度計(上海光譜儀器有限公司),ElX-800型酶聯(lián)免疫檢測儀(美國Bio-Tek公司)。
1.3 方法
1.3.1 細胞培養(yǎng) 用含10%熱滅活胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基,置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HepG2細胞,2~3 d傳代1次,取對數(shù)生長期細胞用于實驗。
1.3.2 MTT比色法 取對數(shù)生長期細胞每孔1×104個細胞/180 μL接種于96孔培養(yǎng)板中,分別加入20 μL/孔的ChR和RA,使其終濃度分別為1.0、10、100 μM,設立完全培養(yǎng)基空白對照組和溶媒對照組(加入相同體積0.02%終濃度DMSO的完全培養(yǎng)基),每組設3個復孔,培養(yǎng)48 h。每孔加入5 g/L的MTT液20 μL,置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,1000 r/min離心10 min,棄上清,每孔加入DMSO 100 μL,震蕩10 min以充分溶解紫藍色沉淀物;用ElX-800型酶標儀以570 nm波長測定吸光度值(A值)。用公式計算細胞增殖相對抑制率:IR(%)=(1-實驗組A均值÷對照組A均值)×100%。以上實驗重復3次。
1.3.3 細胞計數(shù) 取對數(shù)生長期細胞以1 mL/孔(2.0×104個/mL)接種于6孔培養(yǎng)板中,分別加入終濃度為1、10、100 μM的ChR和RA,設立完全培養(yǎng)基空白對照組和溶媒對照組。每組設3個復孔,孵育48 h后,臺盼藍染色后分別計活細胞數(shù)和死細胞數(shù)。按公式計算細胞存活率:CSR=處理組活細胞均數(shù)/空白對照組活細胞數(shù)×100%。實驗重復3次。
1.3.4 細胞及微管微絲形態(tài)觀察 采用細胞爬片技術(shù),取對數(shù)生長期HepG2細胞接種于含滅菌蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中,每孔2×104個,待4 h細胞貼壁后,分別加入終濃度為10 μmol/L的ChR和RA,設立空白對照組和溶媒對照組,每組設3個平行孔。培養(yǎng)48 h后取出蓋玻片,瑞氏-吉姆薩染色后觀察細胞形態(tài),考馬斯亮藍染色后觀察細胞微管微絲排列的變化。
1.3.5 細胞樣品的制備 取對數(shù)生長期的細胞2×104個/mL接種于50 mL培養(yǎng)瓶,每瓶1 mL,分別加入終濃度為10 μmol/L的ChR和RA,同時設立空白對照組和溶媒對照組,每組設3個平行瓶。藥物分別處理24、48、72、96 h。分別收集細胞和細胞培養(yǎng)液。細胞裂解液超聲破碎裂解細胞,離心取上清于-80℃保存。
1.3.6 生化檢測 放免法測定細胞培養(yǎng)液中的AFP含量;自動生化儀檢測細胞裂解液中γ-GTA和ALP的活性;Diamondstone分光光度法測定細胞裂解液中TAT的含量(速率法)。
2.1 MTT法檢測ChR對HepG2細胞增殖活性的影響1 μM、10 μM、100 μM的ChR和RA處理48 h后,與溶媒對照組相比,ChR和RA均能顯著降低HepG2細胞的增殖活性,并呈濃度依賴性(見表1)。ChR的作用效價強度與誘導劑RA相當。
表1 ChR對HepG2細胞增殖活性的影響Tab.1 The effect of ChR on proliferation activity of HepG 2 cells
2.2 細胞計數(shù)法檢測ChR對HepG2細胞生長的影響ChR(1 μM,10 μM 和 100 μM)作用 48 h,HepG2 細胞存活率顯著降低,并呈濃度依賴性(見表2)。ChR降低HepG2細胞存活率的作用效價強度與誘導劑RA相當。
表2 ChR對HepG2細胞生長的影響Tab.2 The effect of ChR on cell viability of HepG 2 cells
2.3 ChR對人肝癌HepG2細胞形態(tài)變化的影響 為了觀察ChR對人肝癌HepG2細胞的誘導作用,用10 μM ChR處理HepG2細胞48 h后姬姆薩染色顯微鏡觀察細胞形態(tài)的變化。結(jié)果顯示:顯微鏡下細胞形態(tài)由原來的卵圓形、多邊形,貼壁疊堆狀生長轉(zhuǎn)變?yōu)殚L梭形或者條形,細胞疊堆狀減少,細胞相互分散。藥物處理后,細胞的細胞核變小,核仁的數(shù)目變少,由多個變?yōu)?個或者2個。而空白對照組和溶媒組的人肝癌HepG2細胞核大而且圓,細胞多且疊堆,核仁明顯,數(shù)目多,細胞質(zhì)較少(見圖1)。結(jié)果表明:經(jīng)藥物處理后,人肝癌HepG2細胞異形性降低,趨向成熟分化。
圖1 ChR處理HepG2細胞48 h后瑞氏-基姆薩染色細胞形態(tài)變化圖(×100)Fig.1 Cell morphological variation of HepG 2 cells treated with ChR for 48 h(×100)
2.4 ChR對人肝癌HepG2細胞微管微絲變化的影響 為了進一步證實ChR對人肝癌HepG2細胞的誘導分化作用,采用考馬斯亮蘭染色顯微鏡觀察10 μM ChR處理HepG2細胞48 h后微管微絲排列的變化。結(jié)果顯示:細胞中微管微絲的數(shù)目顯著增多,排列也變得更加整齊,微管微絲表面出現(xiàn)一些突起,呈正常成熟細胞的一些微管微絲所具有的形態(tài)。而對照組和溶媒組的細胞微管微絲的數(shù)目少,排列也非常不規(guī)則(見圖2)。
圖2 考馬斯亮蘭染色顯微鏡觀察ChR對HepG2細胞微管微絲形態(tài)變化的影響(×100)Fig.2 Tubulin arrangement variation of HepG 2 cells treated with ChR for 48 h(×100)
2.5 ChR對HepG2人肝癌細胞特異性酶和蛋白的影響10μM的ChR孵育HepG2細胞24、48、72、96 h后,藥物處理組和對照組的AFP分泌量和γ-GT含量以24 h為最高,而后隨孵育時間的增加而逐漸降低,每個時相點ChR處理組的AFP分泌量和γ-GT含量明顯低于溶媒組(P<0.01),且呈時間依賴性(見圖3A、3C),說明ChR能有效下調(diào)HepG2細胞AFP的分泌和抑制γ-GT的合成。與此同時,藥物干預細胞后每個時相點ChR處理組的ALP和TAT酶活性顯著高于溶媒組(P<0.05,P<0.01),并隨處理時間的增加而增強(見圖3B、3D),提示ChR能有效地上調(diào)HepG2細胞中ALP和TAT活性。
圖3 ChR對HepG2人肝癌細胞特異性酶和蛋白表達的影響A. 對AFP分泌量的影響;B. 對ALP酶活性的影響;C. 對γ-GT酶活性的影響;D. 對TAT酶活性的影響*P<0.05,**P<0.01,ChR 組與溶媒對照組比較Fig.3 The effect of ChR on the expression of specific enzymes and proteins in HepG 2 human primary hepatocacinoma cellsA. AFP secretion;B. ALP activity;C. γ-GT activity;D. TAT activity*P<0.05,**P<0.01,compared with vehicle control
大量研究已證明,黃酮類化合物對腫瘤細胞的生長與增殖具有抑制作用,如Ko等研究發(fā)現(xiàn)木樨草素能誘導人白血病HL-60細胞凋亡及抑制HL-60細胞增殖[11]。白楊素為天然的黃酮類化合物,已有研究證實其對多種腫瘤細胞具有抑制效應。本研究發(fā)現(xiàn)白楊素能夠明顯地抑制人肝癌HepG2細胞的生長與增殖,并誘導其分化逆轉(zhuǎn),使人肝癌HepG2細胞增殖速度下降。
形態(tài)學上的分化是惡性腫瘤分化的標志。一般來說,腫瘤細胞的惡性程度越高,細胞的細胞核就越大,且核仁的數(shù)目也較多。腫瘤細胞內(nèi)的細胞器也簡單,數(shù)目少,微管微絲的數(shù)目也遠低于正常的細胞。在本研究發(fā)現(xiàn),人肝癌HepG2細胞經(jīng)白楊素誘導后,細胞形態(tài)由原來的卵圓形、多邊形,貼壁疊堆狀生長轉(zhuǎn)變?yōu)殚L梭形多者條形,細胞疊堆狀減少,細胞相互分散,細胞的細胞核變小,核仁的數(shù)目也變少,由多個變?yōu)橐粋€或者兩個。同時觀察到經(jīng)誘導后的細胞中微管微絲的數(shù)目顯著增多,排列也變得更整齊,微管微絲表面出現(xiàn)一些突起,呈現(xiàn)成熟細胞中微管微絲所具有的形態(tài)。這些結(jié)果提示,在白楊素的誘導下,人肝癌HepG2細胞已經(jīng)在形態(tài)上向正常細胞分化了。
為探討人肝癌HepG2細胞分化的定量指標,本研究根據(jù)肝細胞的代謝特點,選取了4種反映肝癌細胞是否分化的特異性酶或蛋白。γ-GT和TAT均為肝癌的標志酶,γ-GT與肝癌的分化程度呈負相關(guān),后者則成正相關(guān)[12]。AFP在肝癌細胞中通常會高表達,而在正常細胞中不表達或低表達,是肝癌的重要標志物[13]。此外,Giani等[14]證明ALP是急性瘤細胞分化的標志,全反式維甲酸能顯著升高肝癌細胞BEL-7402細胞中ALP的活力,表明ALP同樣可作為肝癌細胞分化的標志物[15]。本研究結(jié)果表明,10 μmol/L的白楊素同全反式維甲酸一樣,可有效地降低HepG2細胞中γ-GT的活性和下調(diào)AFP的表達,明顯提高ALP的含量和TAT活性,且呈明顯的時效關(guān)系,這與許多分化誘導劑對人肝癌細胞相關(guān)酶與蛋白的影響一致。綜合以上結(jié)果,證實了白楊素可以抑制人肝癌HepG2細胞的生長與增殖,并能誘導其向成熟細胞分化,為將其開發(fā)為治療人肝癌的誘導分化藥物提供了理論資料。
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Differentiation of HepG 2 cell induced by chrysin
WEN Hong-bo, CAO Yun-changΔ, YU Jia, WANG Wu-zhou
(Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Pharmacy and Life Science, University of South China,Hengyang 421001, China)
ObjectiveTo investigate the effects of chrysin(ChR) on the induction of differentiation and apoptosis-promoting of HepG 2 human primary hepatocacinoma cells.MethodsThe HepG 2 cells were cultured in vitro and divided to four groups, control group, vehicle group, RA (alltrans retinotic acid) group and ChR group (10 μM), Gimsa staining and Coomassie brilliant blue staining were applied to observe the alterations of nucleocytoplasm and tubulin arrangement in HepG2 cells. The alterations of nucleocytoplasm and tubulin arrangement after Gimsa staining and Coomassie brilliant blue staining were observed. The survival rate and the inhibitory rates of HepG 2 cells were determine by trypan blue counting method and MTT assay. The Alpha-fetoprotein(AFP) secretory amounts of the cells were detected by radioimmunoassay(RIA). The activities of alkaline phosphatase(ALP) and γ-glutamyltranspeptidase(γ-GT) were assayed by enzymatic reaction kit. The synthesis of tyrosine-α-ketoglutaric acid transaminase(TAT) in cells were investigated by Diamondstone spectrophotometry.ResultsAfter treatment with ChR or RA at 1.0~100 μmol/L for 48 h, the proliferation of HepG 2 cells were inhibited significantly, compared with vehicle group (P<0.05 or P<0.01), the inhibitory potency of both ChR and RA on HepG 2 cells was equivalent and indicated in dose-dependent manner. After treatment with 10 μmol/L ChR or RA for 48 h, HepG 2 cells disaggregated and grew to spindle-shape, their nuclei became smaller and the number of nucleolus were fewer. Furthermore, tubulin arrangement of cells tended to be more ordered and the tubulin synthesis increased significantly. At 24~96 hours treated with 10 μmol/L ChR, the activities of TAT and ALP in cells were all increased distinctly (P<0.05, P<0.01), and the secretory amounts of AFP and the specific activities of γ-GT were decreased significantly (P<0.05, P<0.01).ConclusionChrysin can inhibit the proliferation of HepG 2 cells and induce them to differentiate to mature cells.
chrysin; HepG2 cells; cell differentiation; flavonoid compounds
R 735.7
A
1005-1678(2014)02-0033-04
目前,惡性腫瘤的誘導分化治療已成為腫瘤生物學和腫瘤治療學的研究熱點和前沿領(lǐng)域,從天然產(chǎn)物、合成化合物及基因治療藥物中尋找新的腫瘤細胞抑制劑和分化誘導劑正不斷取得進展。在眾多的分化誘導劑中,黃酮類化合物是迄今發(fā)現(xiàn)的效果較好的一類化合物,黃酮類化合物是指一類從自然界各種植物中提取的呈黃色、不溶于水、無特殊氣味等性質(zhì)的化合物[1]。白楊素是從紫葳科植物木蝴蝶中提取的一類具有廣泛藥理作用的黃酮類化合物,化學名為5,7-二羥黃酮。已有研究表明,白楊素及其衍生物能顯著抑制人卵巢癌A2780細胞[2],人肺癌A549細胞[3],人胃癌SGC-7901細胞[4],人鼻咽癌CNE-2細胞[5],人結(jié)腸癌HT-29細胞[6]等腫瘤細胞的生長并誘導其凋亡,且呈現(xiàn)劑量和時間依賴性;經(jīng)過硝化作用后的白楊素能夠抑制小鼠Lewis肺癌皮下移植瘤和肺轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)[7];白楊素和它的四乙基二磷酸酯對Hela細胞也具有增殖抑制和誘導凋亡的作用[8]。白楊素還能抑制小鼠乳腺癌4T1細胞的轉(zhuǎn)移性進展[9];Pichichero等[10]證實白楊素能抑制人黑色瘤A375細胞的增殖,還能誘導其分化。以上研究多集中在白楊素對多種腫瘤細胞的增殖抑制和促凋亡作用上,而對腫瘤細胞的誘導分化作用研究不多。白楊素對人肝癌HepG2細胞是否具有生長抑制作用,并能否誘導其分化為成熟細胞,目前報道較少。本研究探討了白楊素是否能用來作為人肝癌HepG2細胞的生長抑制劑和分化誘導劑,為人肝癌治療尋找高效、低毒的活性化學分子即先導物提供實驗和理論依據(jù)。
湖南省自然科學基金(06 JJ 30016);衡陽市科技局項目(2009 KJ 09)
文紅波,女,碩士,實驗師,研究方向:腫瘤藥理學研究,E-mail:wenhongbo-1437@tom.com;曹運長,通信作者,男,博士,副教授,研究方向:動脈粥樣硬化分子機制研究,E-mail:caoychang@163.com。