紫杉醇聯(lián)合金雀異黃素用于肺癌細胞的抑制效果評估

孫平，侯東彬

（華中農(nóng)業(yè)大學醫(yī)院，湖北 武漢 430070）

紫杉醇聯(lián)合金雀異黃素用于肺癌細胞的抑制效果評估

孫平，侯東彬Δ

（華中農(nóng)業(yè)大學醫(yī)院，湖北 武漢 430070）

目的探討紫杉醇（paclitaxel，PTX）聯(lián)合金雀異黃素對肺癌細胞的抑制作用。方法將肺癌A549細胞隨機分為生理鹽水組、紫杉醇干預組、金雀異黃素干預組和聯(lián)合干預組。MTT法研究紫杉醇聯(lián)合金雀異黃素對肺癌A 549細胞的增殖抑制情況。流式細胞術(shù)檢測給藥后腫瘤細胞凋亡情況。建立A 549肺癌裸鼠移植瘤模型，計算抑瘤率。結(jié)果肺癌A 549細胞給藥48 h后，紫杉醇干預組、金雀異黃素干預組和聯(lián)合干預組對腫瘤細胞的抑制率分別為（57．0±4．5）%、（34．0±4．6）%和（77．0±4．4）%，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0．01）；紫杉醇干預組、金雀異黃素干預組和聯(lián)合干預組凋亡率分別為63．4%、41．2%和84．5%，而生理鹽水組凋亡率為7．6%，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0．01）；荷瘤小鼠實驗結(jié)果顯示，相比于生理鹽水組，金雀異黃素組、紫杉醇組和聯(lián)合干預組對腫瘤生長的抑制率分別為（18．2±3．4）%、（32．1±4．2）%和（63．4±5．1）%，聯(lián)合干預組與其他單獨給藥組間差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0．01）。結(jié)論紫杉醇與金雀異黃素均具有抑制肺癌細胞增殖的作用，2者聯(lián)用能夠發(fā)揮協(xié)同作用，增強抗腫瘤能力。

紫杉醇；金雀異黃素；肺癌細胞；聯(lián)合

1 材料與方法

1.1 材料 胎牛血清購自浙江四季青生物科技有限公司；金雀異黃素購自美國sigma公司，批號：G 131208；DMEM培養(yǎng)基購自賽默飛世爾生物化學制品（北京）有限公司；MTT試劑盒購自sigma公司；紫杉醇購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，（批號：S121105）；其余試劑為分析純。A549人源性肺癌細胞購自上海細胞研究所；雄性裸鼠（20～25 g）購自山東大學醫(yī)學院實驗動物中心，動物許可證號：SDDX 201308231。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將A549細胞置于含有100 mg/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為5%CO2，濕度為13.5%，溫度為37℃。待細胞匯合度為0.8～0.9時，用2.5 mg/L胰酶消化傳代，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.2.2 MTT實驗考察不同藥物干預對A549的增殖抑制作用 培養(yǎng)A549細胞接種于96孔板中，隨機分為生理鹽水組、紫杉醇干預組、金雀異黃素干預組和聯(lián)合干預組。當孔板中細胞完全貼壁且處于對數(shù)生長期時，分別加入無菌過濾后的紫杉醇（3 μg/mL）、金雀異黃素（3 μg/mL）、紫杉醇+金雀異黃素(紫杉醇，3 μg/mL＋金雀異黃素，3 μg/mL)各 20 μL。將孔板移入37℃ CO2孵箱中培養(yǎng)24 h和48 h后取出，每孔加入20 μl 5 mg/mL MTT溶液，再放回孵箱中繼續(xù)孵育4h，將孔板中液體倒出，每孔加入200 μL DMSO，37℃避光振搖15 min，用酶標儀在490 nm處測定各孔的光密度值（OD）。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡 培養(yǎng)A549細胞接種于96孔板中，當孔板中細胞完全貼壁且處于對數(shù)生長期時加入無菌過濾后的紫杉醇（3 μg/mL）、金雀異黃素（3 μg/mL）、紫杉醇+金雀異黃素(紫杉醇，3 μg/mL +金雀異黃素，3 μg/mL)各20 μL。將孔板移入37℃CO2孵箱中培養(yǎng)24 h后將A549細胞給藥孵育24 h，然后用冰PBS清洗細胞3次，F(xiàn)ITC/PI雙染，細胞避光放置15 min，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡數(shù)量。

1.2.4 肺癌異位腫瘤模型的建立 A549細胞經(jīng)胰酶消化，離心后將其懸浮于DMEM培養(yǎng)液中，計數(shù)調(diào)節(jié)濃度至5×107個/mL。取4～6周齡，體重20～25 g的雄性裸鼠，將準備好的A549細胞懸濁液皮下接種于裸鼠背部，每只裸鼠接種0.1 mL細胞懸濁液。接種后1～2周可見背部長出腫瘤塊，證明接種成功。將優(yōu)選后的24只荷瘤裸鼠隨機分成4組：生理鹽水組、紫杉醇干預組（20 mg/kg）、金雀異黃素干預組（20 mg/kg）和紫杉醇（10mg/kg）+金雀異黃素（10 mg/kg）組。各組均采用腹腔注射給藥，第21天處死小鼠，剖腫瘤，稱重。取腫瘤切片，按照試劑盒提供的說明書進行TUNEL染色檢測。

2 結(jié)果

2.1 對A549腫瘤細胞增殖的影響 MTT實驗結(jié)果顯示，紫杉醇和金雀異黃素均能抑制A549肺癌細胞的增殖。當紫杉醇和金雀異黃素聯(lián)合用藥時對腫瘤細胞的抑制能力大于單獨用藥。給藥48 h后，紫杉醇干預組、金雀異黃素干預組和聯(lián)合干預組對腫瘤細胞的抑制率分別為（57.0±4.5）%、（34.0±4.6）%和（77.0±4.4）%，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與生理鹽水組相比，單獨給藥組和聯(lián)合給藥組均能有效抑制腫瘤細胞增殖，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，見表 1）。

表1 不同干預方法對肺癌細胞的增殖抑制率（%）Tab.1 The inhibition rate of A549 cell by different treatments at 24 h and 48(%)

2.2 對A549腫瘤細胞凋亡的影響 體外研究藥物誘導A549細胞凋亡的定量實驗結(jié)果顯示，紫杉醇、金雀異黃素和聯(lián)合給藥都能不同程度誘導腫瘤細胞的凋亡。紫杉醇、金雀異黃素和聯(lián)合給藥誘導腫瘤細胞凋亡率分別為63.4%、41.2%和84.5%，而生理鹽水組凋亡率為7.6%。與生理鹽水組相比，單獨給藥組和聯(lián)合給藥組均能有效誘導腫瘤細胞凋亡，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與紫杉醇和金雀異黃素單獨給藥相比，聯(lián)合給藥能夠增強藥物誘導腫瘤細胞凋亡作用，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，見圖1）。

圖1 不同藥物干預誘導肺癌細胞凋亡

2.3 對皮下移植腫瘤的影響 對荷瘤小鼠的治療實驗結(jié)果表明，生理鹽水組腫瘤體積生長速度快，金雀異黃素組、紫杉醇組和聯(lián)合干預組腫瘤生長依次減慢。相比于生理鹽水組，金雀異黃素組、紫杉醇組和聯(lián)合干預組對腫瘤生長的抑制率分別為（18.2±3.4）%、（32.1±4.2）%和（63.4±5.1）%，聯(lián)合干預組與其他單獨給藥組間差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，見表1）。各組裸鼠腫瘤組織切片后TUNEL染色，棕色代表凋亡的腫瘤細胞，圖2可見，聯(lián)合干預組誘導凋亡的腫瘤細胞最多，其次是紫杉醇干預組和金雀異黃素干預組。

表2 不同干預方法對肺癌移植瘤的抑制率Tab.2 The inhibition rate of tumor in A549 bearing nude mice by different treatments

圖2 腫瘤組織切片TUNEL染色（×200）Fig.2 HE stained tumor tissues(×200)

3 討論

肺癌是全球最普遍發(fā)生的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率居全球惡性腫瘤之首[10]。當前肺癌治療效果不理想，其主要原因是早期診斷率不高，大多數(shù)患者被確診為肺癌時已是中晚期或出現(xiàn)了遠端轉(zhuǎn)移。因此研究新的肺癌治療方法顯得十分重要。紫杉醇是臨床常用的細胞毒類抗腫瘤藥物。金雀異黃素是已經(jīng)被報道對多種腫瘤細胞具有抑制作用，金雀異黃素是一種低毒、高效的抗癌成分，對腫瘤細胞具有多靶點的抑制作用[11-13]。目前國內(nèi)外尚未見到金雀異黃素與化療藥物聯(lián)合作用于肺癌的報道。

本研究將臨床上已經(jīng)證實的抗腫瘤藥物紫杉醇與金雀異黃素聯(lián)合使用，結(jié)果顯示：紫杉醇與金雀異黃素聯(lián)合使用能夠顯著抑制肺癌A549細胞的增殖。很多藥物通過誘導細胞凋亡來抑制腫瘤細胞的增殖，結(jié)果顯示聯(lián)合用藥對于誘導腫瘤細胞凋亡的能力顯著強于紫杉醇或者金雀異黃素單獨給藥，說明紫杉醇和金雀異黃素聯(lián)合給藥能夠?qū)δ[瘤細胞凋亡起到協(xié)同作用。此外，還通過體內(nèi)腫瘤異位模型考察了聯(lián)合給藥對腫瘤生長的抑制能力，結(jié)果與體外研究結(jié)果相一致。綜上所述，紫杉醇和金雀異黃素聯(lián)合使用能夠有效抑制肺癌的發(fā)展，是一種潛在的肺癌治療手段。對于金雀異黃素抑制腫瘤的機制可能與其阻斷腫瘤細胞β-catenin信號途徑，下調(diào)β-catenin核表達，上調(diào)其胞膜表達有關(guān)[14-15]。金雀異黃素抑制腫瘤的機制目前還在進一步的研究中。

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Evaluating the effect of paclitaxel and genistein on lung cancer A549 cell

SUN Ping，HOU Dong-binΔ

(Hospital of Central China Agricultural University,Wuhan 430070,China)

ObjectiveTo evaluate the effect of paclitaxel and genistein on the treatment of lung cancer.MethodsA549 cells were divided into saline group, PTX group, Gen group and (PTX+Gen) group. The anti-proliferation efficiency of paclitaxel combined with genistein was evaluated by MTT assay and flow cytometry test. A 549 cells were injected into mice by hypodermic in order to establish the animal model, which were used to evaluate the effect of anti-tumor.ResultsThe cell viability of A 549 cells were(57.0±4.5)%,(34.0±4.6)% and (77.0±4.4)% after the treatment of paclitaxel, genistein and paclitaxel+ genistein, respectively(P＜0.01). The effect of saline induced cells apoptotic was 7.6%,while paclitaxel,genistein and paclitaxel + genistein were 63.4%、41.2% and 84.5%, respectively(P＜0.01).The tumor inhibitory rates were(18.2±3.4)%, (32.1±4.2)%and(63.4±5.1)% in vivo for genistein, paclitaxel and paclitaxel+ genistein(P＜0.01).ConclusionBoth paclitaxel and genistein can inhibit the growth of lung cancer cell lines, and the combination of paclitaxel and genistein may be a potentially effective treatment for lung cancer.

paclitaxel; genistein; lung cancer; combination

R 734．2

A

1005-1678(2014)02-0001-03

肺癌作為嚴重威脅人類健康的頭號惡性腫瘤，國內(nèi)每年新發(fā)肺癌患者約50萬，到2025年預計我國每年將新發(fā)100萬肺癌患者[1]。肺癌的治療以手術(shù)為主，聯(lián)合化療為輔。擺在臨床醫(yī)師特別是腫瘤治療醫(yī)師面前的任務(wù)是極其繁重和艱巨的。當前肺癌治療效果不理想，其主要原因是早期診斷率不高，大多數(shù)患者被確診為肺癌時已是中晚期或出現(xiàn)了遠端轉(zhuǎn)移。紫杉醇是來源于紅豆杉屬太平紫杉的一種細胞毒性物質(zhì)，被廣泛用于乳腺癌[2]、卵巢癌[3]、肝癌[4]和非小細胞肺癌的治療[5]。然而，以細胞毒為主的化學治療缺乏選擇性，難免產(chǎn)生許多不良反應和毒性，病人耐受性較差。肺癌的治療迫切需要新的手段。紫杉醇能夠通過干擾細胞有絲分裂和分裂間期細胞功能所必需的微管網(wǎng)絡(luò)而起抗腫瘤作用。紫杉醇可與游離的微管蛋白結(jié)合，促進微管蛋白裝配成穩(wěn)定的微管，同時抑制其解聚，導致喪失了正常功能的微管束的產(chǎn)生和微管的固定，從而抑制細胞的有絲分裂[6]。金雀異黃素是異黃酮類化合物的主要成分之一，廣泛分布在大豆、黃芪、葛根等植物中，具有多種生理及藥理活性。研究表明，金雀異黃素可抑制多種腫瘤細胞的生長且具有抗癌增敏作用[7-9]，被認為是一種很有潛力的腫瘤抑制劑。金雀異黃素能在體內(nèi)外抑制腫瘤細胞增殖和誘導凋亡，還可阻斷腫瘤細胞β-catenin信號途徑，下調(diào)β-catenin核表達，上調(diào)其胞膜表達。本研究擬探討金雀異黃素聯(lián)合紫杉醇對肺癌A549細胞增殖的影響以及對荷瘤小鼠腫瘤的治療效果，為臨床治療提供更多的實驗依據(jù)。

國家自然科學基金（81171365）

孫平，男，本科，主治醫(yī)師，研究方向：肺癌的基礎(chǔ)與臨床治療研究，E-mail：2094252562@qq.com；侯東彬，通信作者，女，本科，副主任醫(yī)師，研究方向：肺癌的基礎(chǔ)與臨床治療研究，E-mail:315652027@qq.com。