胰腺癌干細(xì)胞中胚胎干性相關(guān)基因的表達(dá)及意義

徐兆國(guó)，張曉曄，齊曉瑩，于莉

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院 腫瘤科，遼寧 沈陽(yáng) 110022）

胰腺癌干細(xì)胞中胚胎干性相關(guān)基因的表達(dá)及意義

徐兆國(guó)，張曉曄Δ，齊曉瑩，于莉

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院 腫瘤科，遼寧 沈陽(yáng) 110022）

目的觀察和分析胰腺癌干細(xì)胞中胚胎干性相關(guān)基因的表達(dá)變化及意義。方法以中科院細(xì)胞庫(kù)人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1為研究對(duì)象，將其配置成單細(xì)胞懸液，與CD24、CD44等進(jìn)行抗體孵育，分選出CD24＋、CD44＋等胰腺癌干細(xì)胞，顯微鏡下觀察胰腺癌干細(xì)胞的形成速度；采用1640培養(yǎng)液誘導(dǎo)干細(xì)胞球細(xì)胞進(jìn)行分化，流式檢測(cè)CD24＋、CD44＋表達(dá)。免疫組化法檢測(cè)胚胎干細(xì)胞標(biāo)志物Oct4和Nano的表達(dá)，CCK8法比較Oct4和Nano細(xì)胞化療藥物的體外耐藥差別。結(jié)果從人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1分離出的CD24＋、CD44＋的胰腺癌干細(xì)胞在1%～3%之間，Oct4和Nano在分選出的細(xì)胞中表達(dá)明顯高于未分選組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論CD24＋、CD44＋細(xì)胞具有胰腺癌干細(xì)胞的高耐藥性等特性，且Oct4和Nano等胚胎干性相關(guān)基因在胰腺癌干細(xì)胞中表達(dá)性高。

胰腺癌干細(xì)胞；胚胎干性相關(guān)基因；表達(dá)；變化

隨著人們生活方式的改變，生活節(jié)奏越來(lái)越快，因胰腺癌入院治療的患者呈逐年上升的趨勢(shì)。近年來(lái)，臨床上加大了對(duì)胰腺癌的研究力度，并取得了一定的進(jìn)展［1］。本研究以中科院細(xì)胞庫(kù)人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1為研究對(duì)象，觀察并分析胰腺癌干細(xì)胞中胚胎干性相關(guān)基因的表達(dá)以及變化意義，具體報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1來(lái)自中科院細(xì)胞庫(kù)。胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和硒混合溶液（ITS，4 g／mL胰島素，2.65 mg／mL轉(zhuǎn)鐵蛋白和2.55 ng／mL硒混合溶液）購(gòu)自 Sigma公司。DMEM／F12培養(yǎng)液，胰蛋白酶、胎牛血清、APC抗人CD44和PE抗人CD24、反轉(zhuǎn)錄試劑盒均為Invitrogen公司產(chǎn)品。PCR試劑盒、兔抗人Oct4、Nanog一抗均為Abcam公司產(chǎn)品。流式細(xì)胞儀（Gallios 7310）、倒置相差顯微鏡（奧林巴斯 CX32）和熒光定量PCR儀 7200（ABI）。

1.2 方法

1.2.1 人胰腺癌細(xì)胞培養(yǎng) 采用含12%胎牛血清（Gibco）的DMEM培養(yǎng)基，人胰腺癌細(xì)胞培養(yǎng)條件為5%CO2，37℃，飽和濕度的恒溫的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 人胰腺癌干細(xì)胞的分選和培養(yǎng) 觀察組將CD24＋、CD44＋干細(xì)胞放置在無(wú)血清的干細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)。對(duì)照組將未分選的細(xì)胞放置于普通細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)。待人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，進(jìn)行消化重懸。在培養(yǎng)基中加入抗人ESA、抗人CD44和抗人CD24，避光條件下孵育0.5 h。添加適量0.26%的胰蛋白酶、37℃消化3 min，1 000 r／min離心5min。PBS清洗細(xì)胞并進(jìn)行計(jì)數(shù)。對(duì)照組不添加抗體，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行篩選和檢測(cè)，將篩選出的CD24＋、CD44＋細(xì)胞置于5%CO2，37℃，飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3 免疫組化法對(duì) Oct4、Nanog的表達(dá)檢測(cè)［3］采用免疫熒光原位法對(duì)Oct4和Nanog進(jìn)行檢測(cè)。用PBS洗滌Oct4、Nanog。4%的多聚甲醛固定，室溫中吃醋培養(yǎng)0.5 h，PBS洗滌3次，加入封閉液（溫度30℃的）中持續(xù)培養(yǎng)1 h。之后加入一抗（1∶200稀釋），4℃放置過(guò)夜。對(duì)照組不加抗體。PBS洗滌3次后采用熒光封面液進(jìn)行封片，觀察結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，正態(tài)計(jì)量資料用“x±s”表示，組間比較用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞流式的分選結(jié)果 將CD24和CD44作為標(biāo)志物，對(duì)人胰腺癌干細(xì)胞進(jìn)行分選，其中雙陰性的細(xì)胞占5%～25%，雙陽(yáng)性細(xì)胞占1%～3%。

2.2 免疫組化法檢測(cè)CD24和CD44基因表達(dá)結(jié)果 分選后的實(shí)驗(yàn)組雙陽(yáng)性干細(xì)胞較對(duì)照組中Oct4和Nanog蛋白數(shù)量明顯增高，且差異主要表達(dá)于細(xì)胞核當(dāng)中（見(jiàn)圖1）。

圖1 Oct4在胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)（×400）Fig.1 Oct4 expression in pancreatic cancer cells（×400）

2.3 CD24＋CD44＋干細(xì)胞的耐藥性 加入不同濃度的吉西他濱2天后，吉西他濱濃度大于100 ng／mL時(shí)觀察組 CD24＋、CD44＋干細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制，2種細(xì)胞的抑制率差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。加藥后48 h，觀察組中CD24＋、CD44＋干細(xì)胞較對(duì)照組細(xì)胞具有更強(qiáng)的耐藥性。見(jiàn)表1。

表1 CD24＋CD44＋干細(xì)胞的耐藥性

3 討論

胰腺癌是臨床上常見(jiàn)的惡性程度非常高的消化道腫瘤，病情嚴(yán)重，容易引發(fā)多種合并癥，致殘率和致死率非常高，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量［4-6］。腫瘤干細(xì)胞理論表明腫瘤的發(fā)生和發(fā)展、轉(zhuǎn)移到復(fù)發(fā)等過(guò)程均與腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cell，CSC）有著密不可分的聯(lián)系，而胰腺癌干細(xì)胞中，Oct4、Nanog等基因是胚胎干細(xì)胞特性保持中的核心物質(zhì)，與胚胎干細(xì)胞類(lèi)似，胰腺癌CSC具有的顯著特征包括多向分化潛能和自我更新功能［7-9］。該類(lèi)胚胎干細(xì)胞相關(guān)基因是否在腫瘤干細(xì)胞中表達(dá)成為醫(yī)學(xué)上研究的重點(diǎn)［10-12］。

本研究以中科院細(xì)胞庫(kù)人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1為研究對(duì)象，將其配置成單細(xì)胞懸液，通過(guò)CD44、CD24等抗體孵育，分選出CD24＋、CD44＋等胰腺癌干細(xì)胞，在顯微鏡下觀察胰腺癌干細(xì)胞的形成速度，并在1640培養(yǎng)液的誘導(dǎo)下對(duì)干細(xì)胞球細(xì)胞進(jìn)行分化，對(duì)CD24和CD44的表達(dá)進(jìn)行流式檢測(cè)。本研究結(jié)果顯示，從人胰腺癌細(xì)胞株株P(guān)ANC分離出的CD24＋、CD44＋胰腺癌干細(xì)胞占1%～3%之間，Oct4和Nanog在分選出的細(xì)胞中表達(dá)高于未分選組，數(shù)據(jù)差異顯著（P＜0.05）。

綜上所述，CD24＋、CD44＋細(xì)胞具有胰腺癌干細(xì)胞的高耐藥性等特性，且Oct4和Nanog等胚胎干性相關(guān)基因在胰腺癌干細(xì)胞中表達(dá)性高。

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（編校：吳茜）

Study on the expression of embryonic stem-related genes in pancreatic cancer stem cells and its significance

XU Zhao-guo，ZHANG Xiao-yeΔ，QIXiao-ying，YU Li

（Department of Oncology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110022，Liaoning Province，China）

ObjectiveTo observe the expression change of embryonic dry related genes in embryonic stem of pancreatic cancer and analyze its significance.MethodsPancreatic cancer cell lines PANC-1 was incubated with with CD24，CD44 antibody incubation，the CD24＋and CD44＋pancreatic cancer stem cells were sorted and pancreatic cancer stem cells’forming speed were observed under amicroscope.The differentiation of stem cellswere induced by 1640 culture，and the expression of CD24＋and CD44＋were detected by flow cytometry.The expression of embryonic stem cell marker Oct4 and Nano were detected by immunohistochemical and the tolerance difference of Oct4 and Nano cell to chemotherapeutic drugs in vitrowere observed and compared by CCK8 method.ResultsThe number of CD24＋and CD44＋isolated from human pancreatic cancer cell lines PANC-1 was1%～3%.Oct4 and Nano expression in sorted cells were significantly higher than un－sorted cells，and the difference was significant（P＜0.05）.ConclusionCD24＋and CD44＋cells has high drug resistance and other characteristics of pancreatic cancer stem cells，and the expression of embryonic stem－related genes Oct4 and Nano are high pancreatic cancer stem cells.

Pancreatic cancer stem cells；Embryo dry related genes；express；change

R735.9

A

1005－1678（2014）03－0055－02

遼寧省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013225021）

徐兆國(guó)，男，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：腫瘤的放化療，E-mail：xzhg_xu＠163.com；張曉曄，通信作者，男，博士，主任醫(yī)師，研究方向：肺癌的綜合治療，E-mail：zhangxiaoye_zhang＠163.com。