維生素D對(duì)2型糖尿病腎病大鼠腎臟中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1重組人膠原蛋白-1和結(jié)締組織生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響

田燕燕++楊燁++張園園+++俞瑞+++肖拉提.依馬木明+朱佳+朱筠

[摘要] 目的 探討維生素D對(duì)糖尿病腎病大鼠轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）和重組人膠原蛋白-1（collagen-1）表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討以上3個(gè)基因在糖尿病腎病中相互作用以及維生素D對(duì)糖尿病腎病大鼠腎臟的保護(hù)作用。 方法 將54只雄性SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組（18只）、模型組（18只）、治療組（18只）。其中，模型組及治療組大鼠均行糖尿病腎病造模，飼以高脂高糖飼料6周，空腹12 h后給予小劑量鏈腺佐菌素腹腔注射。注射1周后，不同日期測(cè)隨機(jī)血糖（GLU）3次，若3次GLU均≥16.7 mmol/L為2型糖尿病大鼠。2型糖尿病成模后的大鼠在6周和7周時(shí)用尿微量蛋白試紙連續(xù)測(cè)大鼠晨尿3次以上，若為陽(yáng)性，則為2型糖尿病腎病的大鼠。治療組給予骨化三醇溶于0.05 mL花生油以0.03 μg/（kg·d）灌胃37 d，模型組給予花生油灌胃37 d。處死大鼠，取腎臟，采用HE、電鏡技術(shù)觀(guān)測(cè)腎臟組織的形態(tài)學(xué)變化，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（RT-PCR）評(píng)價(jià)腎臟TGF-β1、collagen-1及CTGF基因表達(dá)的變化。 結(jié)果 ①模型組TGF-β1、collagen-1及CTGF基因表達(dá)高于正常對(duì)照組（P < 0.05），治療組TGF-β1、collagen-1及CTGF基因表達(dá)明顯低于模型組（P < 0.05）。② 采用HE、電鏡技術(shù)可以看出治療組病理組織形態(tài)學(xué)，尤其是組織結(jié)構(gòu)完整性明顯優(yōu)于模型組。 結(jié)論 糖尿病腎病大鼠中，維生素D可以通過(guò)下調(diào)TGF-β1、collagen-1及CTGF基因的表達(dá)，對(duì)糖尿病腎病起保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞] 糖尿病腎??；維生素D；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子1；結(jié)締組織生長(zhǎng)因子；重組人膠原蛋白-1

[中圖分類(lèi)號(hào)] R587.1[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A[文章編號(hào)] 1673-7210（2014）06（b）-0008-05

Effect of vitamin D on the expression of growth factor growth factor beta 1, recombinant human collagen-1 and connective tissue growth factor in kidney of rats with type 2 diabetic nephropathy

TIAN Yanyan YANG Ye ZHANG Yuanyuan YU Rui Xiaolati·Yimamuming ZHU Jia ZHU Jun▲

Department of Endocrinology, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Xinjiang Uygur Autonomous Region, Urumchi 830000, China

[Abstract] Objective To explore the effect of vitamin D on the expression of transforming growth factor-β1 (TGF-β1), connective tissue growth factor (CTGF) and restructuring of collagen-1 (collagen-1) in diabetic nephropathy rat, discuss their interaction in diabetic nephropathy, and the protective effect of vitamin D for the kidney of diabetic nephropathy rat. Methods 54 male SD rats were randomly divided into three groups: normal control group (n=18), model group (n=18), treatment group (n=18). The model group and treatment group rats were established diabetic nephropathy model, and fed with high fat diet for 6 weeks, then intraperitoneal injection of small dose streptozotocin after fasting for 12 hours. 1 week after injection, 3 times of blood glucose (GLU) on a different date were measured, if 3 times of GLU all ≥16.7 mmol/L indicated that rats had type 2 diabetes mellitus. 6 and 7 weeks after type 2 diabetes mellitus model establishment, trace protein urine dipstick was used for detection of the morning urine of rats for at least 3 times, if the results were positive, indicated that rats had type 2 diabetic nephropathy. The treatment group was given 0.03 μg/(kg·d) calcitriol dissolved in 0.05 mL peanut oil by intragastric administration for 37 d. The model group was given peanut oil by intragastric administration for 37 d. After treatment all rats were killed, and the kidneys were removed. HE, electron microscopy were used for morphological changes observation of renal tissue, real-time fluorescence quantitative PCR (RT-PCR) was used for evaluation of expression changes of renal TGF-β1, collagen-1 and CTGF genes. Results ①The expression of TGF-β1, collagen-1 and CTGF genes in the model group were significantly higher than those in the normal control group (P < 0.05), which in the treatment group were significantly lower than those in the model group (P < 0.05). ②The results of HE, electron microscopy showed that in the treatment group the pathological tissue morphology, especially organizational structure integrity was better than that of model group significantly. Conclusion Vitamin D can down regulate the expression of TGF- β1, collagen-1 and CTGF genes, has protective effect on diabetic nephropathy for the diabetic nephropathy rats.

endprint

[Key words] Diabetic nephropathy; Vitamin D; Transforming growth factor 1; Connective tissue growth factor; Recombinant human collage-1

糖尿病腎病是糖尿病常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥，其主要的病理改變是毛細(xì)血管基底膜增厚及系膜基質(zhì)增生，最終導(dǎo)致腎小球硬化。目前在歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家位居終末期腎病病因的首位[1]，在我國(guó)也上升至終末期腎病病因的第2位，約占總終末期腎病的25%[2-3]，目前仍然處于上升的趨勢(shì)。近年活性維生素D3（1，25-二羥維生素D3，骨化三醇）的腎臟保護(hù)作用受到關(guān)注，本研究通過(guò)觀(guān)察活性維生素D3對(duì)糖尿病腎?。―N）模型大鼠腎臟病程進(jìn)展的作用以及維生素D3對(duì)DN模型大鼠轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）和重組人膠原蛋白-1（collagen-1）表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討維生素D3對(duì)相關(guān)基因在糖尿病腎病發(fā)生和發(fā)展中的可能作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 動(dòng)物清潔級(jí)雄性SD大鼠54只（由新疆維吾爾自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心提供），平均體重（280±10）g。動(dòng)物生產(chǎn)和使用許可證號(hào)分別為：scxk（新）2011-0001和syxk（新）2011-0002。本研究經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)同意。

1.1.2 主要試劑鏈脲佐菌素（STZ，美國(guó)SIGMA），骨化三醇膠丸（上海羅氏制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字J201000 56，0.25 μg/粒），兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗體（美國(guó)abcam公司），兔抗大鼠CTGF多克隆抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司），兔抗大鼠collagen-1多克隆抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司），尿液分析試紙條（ARKRAY Factory，Japan），PCR試劑RNeasy Mini Kit （Qiagen，Hilden，Germany），QuantiTect Rev. Transcription Kit（Qiagen，Hilden，Germany），QuantiFast SYBR green PCR Master Mix （Qiagen，Hilden，Germany），多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Bio-rad，IQ5，USA）。

1.2 方法

1.2.1 分組、建模及標(biāo)本收集將54只雄性SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組（18只）、模型組（18只）、治療組（18只）。模型建立：正常對(duì)照組飼以普通飼料喂養(yǎng)，模型組及治療組，飼以高脂高糖飼料6周（飼料配方：10%煉豬油，20%蔗糖，2%膽固醇，8%蛋黃粉，60%普通飼料），大鼠空腹12 h后給予小劑量STZ（30 mg/kg溶入pH為4.5的檸檬酸緩沖液）腹腔注射。注射1周后，測(cè)隨機(jī)血糖，若血糖值≥16.7 mmol/L者為2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）大鼠；若血糖值≥1次未達(dá)標(biāo)者測(cè)空腹血糖（FPG）和葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)2 h血糖（2 h PG，葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，空腹剪尾取血測(cè)FPG，繼以葡萄糖2 g/kg灌胃，于120 min 時(shí)取血測(cè)血糖），取FPG≥7.0 mmol/L和（或）2 h PG≥11.1 mmoI/L者為2型糖尿病大鼠。2型糖尿病成模大鼠在STZ注射后6周和7周時(shí)用尿微量蛋白試紙連續(xù)測(cè)晨尿3次以上，若為陽(yáng)性，則為2型糖尿病腎病的大鼠。2型糖尿病腎病建模成功后，治療組給予骨化三醇溶于0.05 mL花生油以0.03 μg/（kg·d）灌胃37 d，模型組給予等量花生油灌胃37 d，正常對(duì)照組不做任何處理。37 d后統(tǒng)一處死，留取大鼠腎臟，分別取組織切片（各尺寸均小于0.5 cm）在室溫下浸入約5倍體積的RNAlater液中，然后將樣品于-20°C保存；在腎皮質(zhì)處切取1 mm×1 mm×1 mm大小腎組織數(shù)塊放入2.5%戊二醛固定；其余腎臟以4%多聚甲醛固定。

1.2.2 腎臟組織HE染色取新鮮腎臟組織用生理鹽水沖洗干凈，然后采用10%福爾馬林固定，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，制成3 μm石蠟切片，行HE染色。

1.2.3 電鏡腎皮質(zhì)處切取1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊，采用戊二醛和鋨酸雙重固定，丙酮梯度脫水，Epon812環(huán)氧樹(shù)脂包埋，LEICAI UC6超薄切片機(jī)進(jìn)行超薄切片，鉛鈾電子染色，JEOL1230透射電子顯微鏡觀(guān)察。

1.2.4 Real-time PCR使用RNeasy Mini Kit提取未處理組和處理組組織中的總RNA，并按照QuantiTect Rev. Transcription Kit的操作說(shuō)明，對(duì)提取出的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。擴(kuò)增cDNA模板的Real-time PCR基因特異性的引物對(duì)見(jiàn)表1。使用包含ROX校正染料的QuantiFast SYBR green PCR Master Mix進(jìn)行定量PCR反應(yīng)。定量PCR擴(kuò)增條件：第一步95℃，5 min；第二步95℃，10 s，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。結(jié)果判斷：采用相對(duì)定量的方法，用內(nèi)參基因β-actin的表達(dá)對(duì)結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化?；颚?actin和TGF-β1的PCR擴(kuò)增效率用梯度稀釋cDNA模板生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行檢測(cè)。所有的實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù)，通過(guò)溶解曲線(xiàn)對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)物的質(zhì)量進(jìn)行控制。TGF-β1的相對(duì)表達(dá)量通過(guò)ΔΔCt方法進(jìn)行計(jì)算：△Ct糖尿病腎病=Ct糖尿病腎病TGF-β1-Ct糖尿病腎病β-actin，△Ct正常= Ct正常TGF-β1-Ct正常樣β-actin，△△Ct = △Ct糖尿病腎病- △Ct正常，TGF-β1在糖尿病腎病樣本和正常樣本中的相對(duì)表達(dá)差異用2-ΔΔCt計(jì)算?；駽TGF、collagen-1表達(dá)量均采用以上方法計(jì)算。

表1 Real-time PCR基因特異性的引物對(duì)

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎臟光鏡改變

正常對(duì)照組可以看到腎小球毛細(xì)血管網(wǎng)與囊壁無(wú)粘連，有完整囊壁結(jié)構(gòu)，毛細(xì)血管網(wǎng)無(wú)閉塞現(xiàn)象，腎小管結(jié)構(gòu)基本正常。模型組與正常對(duì)照組相比，系膜細(xì)胞增生明顯，腎小球毛細(xì)血管網(wǎng)與囊壁有粘連現(xiàn)象，無(wú)囊壁結(jié)構(gòu)，毛細(xì)血管網(wǎng)無(wú)閉塞現(xiàn)象。治療組與模型組相比，系膜細(xì)胞稍有增生，腎小管擴(kuò)張不明顯，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)少，毛細(xì)血管網(wǎng)與囊壁無(wú)粘連，囊壁結(jié)構(gòu)完整，毛細(xì)血管網(wǎng)無(wú)閉塞現(xiàn)象。見(jiàn)圖1。

2.2 腎臟電鏡改變

正常對(duì)照組腎小管上皮細(xì)胞細(xì)胞核形態(tài)規(guī)整，核圓，線(xiàn)粒體豐富，結(jié)構(gòu)正常，呈橢圓形，可見(jiàn)少量溶酶體，微絨毛排列整齊，腎小管基膜光滑。模型組腎小管基底膜皺縮可見(jiàn)大量丘狀隆起，小管間毛細(xì)血管腫脹明顯，局部出現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞空泡變，可見(jiàn)壞死脫落。治療組腎小管結(jié)構(gòu)基本正常，線(xiàn)粒體豐富，上皮細(xì)胞較正常，有質(zhì)膜間隙增寬，基底膜基本光滑。通過(guò)電鏡觀(guān)察不難看出，模型組腎臟結(jié)構(gòu)的病理變化明顯，結(jié)構(gòu)不完整，局部可見(jiàn)到明顯的壞死脫落，治療組腎小管、腎小球結(jié)構(gòu)較模型組相比基本正常。見(jiàn)圖2。

endprint

圖2 各組腎小管及腎小球的電鏡觀(guān)察（6000×）

2.3 各組CTGF、TGF-β1、collagen-1基因表達(dá)情況

模型組CTGF、TGF-β1、collagen-1基因的表達(dá)量明顯高于正常對(duì)照組（P < 0.05）；治療組CTGF、TGF-β1、collagen-1基因表達(dá)量低于模型組（P < 0.05）。見(jiàn)表2、圖3~5。

與正常對(duì)照組比較，*P < 0.05；與模型組比較，#P < 0.05

圖3 各組腎臟組織CTGF基因表達(dá)變化

與正常對(duì)照組比較，*P < 0.05；與模型組比較，#P < 0.05

圖4 各組腎臟組織TGF-β1基因表達(dá)變化

與正常對(duì)照組比較，*P < 0.05；與模型組比較，#P < 0.05

圖5 各組腎臟組織collagen-1基因表達(dá)變化

表2 各組CTGF、TGF-β1、collagen-1基因表達(dá)情況（x±s）

注：與正常對(duì)照組比較，*P < 0.05；與模型組比較，#P < 0.05；TGF-β1：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1；collagen-1：重組人膠原蛋白-1；CTGF：結(jié)締組織生長(zhǎng)因子

3 討論

TGF-β1是一種廣泛分布于多種細(xì)胞組織中的多肽類(lèi)調(diào)控蛋白，在腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化發(fā)生、發(fā)展中起作用，被認(rèn)為是誘導(dǎo)腎小管間質(zhì)纖維化的重要細(xì)胞因子之一[4-5]。腎小管間質(zhì)纖維化以過(guò)量細(xì)胞外基質(zhì)在正常腎小管和腎間質(zhì)聚集為特征，被認(rèn)為是各種不同病因所致慢性腎臟疾病進(jìn)展至終末期腎衰竭的共同病理途徑。腎小管間質(zhì)纖維化的早期防治對(duì)腎臟疾病轉(zhuǎn)歸有重要意義[6]。

CTGF是抗纖維化作用因子之一，是一種富含半胱氨酸的多肽[7]。Bradham等[8]于1991年首次發(fā)現(xiàn)了這種細(xì)胞因子。據(jù)研究，在生理狀態(tài)時(shí)，腎間質(zhì)內(nèi)有少量CTGF，在某些病理狀態(tài)下，CTGF表達(dá)量顯著增加。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也表明，各種纖維化疾病模型中，CTGF的表達(dá)都顯著升高[9]。CTGF生物學(xué)效應(yīng)較為單一，因此阻斷CTGF表達(dá)或抑制其活性，可能是一種預(yù)防纖維化的有效手段[10-12]。

近年來(lái)維生素D，尤其是其活性代謝產(chǎn)物活性維生素D[1，25-（OH）2D3]對(duì)糖尿病腎病的腎臟保護(hù)作用備受關(guān)注。有研究表明，維生素D主要是減少腎臟足細(xì)胞肥大及丟失，進(jìn)而減輕蛋白尿及腎小球硬化[13]，抑制高糖誘導(dǎo)的血管緊張素原和腎素表達(dá)，繼而抑制細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，抑制白細(xì)胞介素（IL）-1、IL-6、腫瘤壞死因子-α等遞質(zhì)的作用，抑制TGF-β1、NF-κB、單核細(xì)胞趨化蛋白（MCP）-1等細(xì)胞因子的表達(dá)，抑制巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)等，抑制炎癥因子分泌，抑制系膜細(xì)胞增殖和保護(hù)足細(xì)胞等活性，對(duì)糖尿病大鼠腎臟損傷有預(yù)防保護(hù)作用[14]。

在本研究中可以發(fā)現(xiàn)，TGF-β1、CTGF、collagen-1在治療組中的基因表達(dá)量高于空白組，低于模型組（P < 0.05），提示糖尿病腎病大鼠的腎臟損傷可能與TGF-β1、CTGF、collagen-1相關(guān)。給予維生素D干預(yù)后，治療組的TGF-β1、CTGF、collagen-1基因的表達(dá)量明顯低于模型組，提示維生素D可能通過(guò)下調(diào)TGF-β1、CTGF、collagen-1基因的表達(dá)來(lái)發(fā)揮腎臟的保護(hù)作用。Tall等[15]的研究結(jié)果提示，CTGF可以被TGF-β1誘導(dǎo)表達(dá)，并作為T(mén)GF-β1主要的下游介質(zhì)介導(dǎo)其促纖維化作用。然而CTGF既可以被TGF-β1調(diào)節(jié)，同時(shí)又是TGF-β1的調(diào)節(jié)者。

通過(guò)光鏡不難看出，模型組與正常對(duì)照組相比存在更嚴(yán)重的腎小球硬化，表現(xiàn)為腎小球系膜區(qū)更多的細(xì)胞外基質(zhì)集聚，相比之下，治療組細(xì)胞外基質(zhì)集聚的量遠(yuǎn)小于模型組。電鏡下可見(jiàn)到模型組腎臟結(jié)構(gòu)的病理變化明顯，結(jié)構(gòu)不完整，局部可見(jiàn)到明顯的壞死脫落，治療組可以發(fā)現(xiàn)腎小管、腎小球結(jié)構(gòu)較模型組相比明顯好轉(zhuǎn)。進(jìn)一步驗(yàn)證了維生素D對(duì)糖尿病腎病的治療效果比較顯著。目前維生素D對(duì)糖尿病腎病發(fā)展的作用尚沒(méi)有報(bào)道，在后期的工作中可以以這點(diǎn)作為方向進(jìn)一步研究維生素D對(duì)糖尿病腎病發(fā)展的具體作用，為臨床工作打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2014-03-03本文編輯：程銘）

[基金項(xiàng)目] 國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（編號(hào)81160116）。

[作者簡(jiǎn)介] 田燕燕（1965.6-），女，新疆烏魯木齊人，新疆醫(yī)科大學(xué)2011級(jí)內(nèi)分泌專(zhuān)業(yè)在讀碩士研究生；研究方向：內(nèi)分泌與基礎(chǔ)代謝。

[通訊作者] 朱筠（1966.7-），女，新疆烏魯木齊人，新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科主任；研究方向：內(nèi)分泌基礎(chǔ)研究。

endprint

圖2 各組腎小管及腎小球的電鏡觀(guān)察（6000×）

2.3 各組CTGF、TGF-β1、collagen-1基因表達(dá)情況

模型組CTGF、TGF-β1、collagen-1基因的表達(dá)量明顯高于正常對(duì)照組（P < 0.05）；治療組CTGF、TGF-β1、collagen-1基因表達(dá)量低于模型組（P < 0.05）。見(jiàn)表2、圖3~5。

與正常對(duì)照組比較，*P < 0.05；與模型組比較，#P < 0.05

圖3 各組腎臟組織CTGF基因表達(dá)變化

與正常對(duì)照組比較，*P < 0.05；與模型組比較，#P < 0.05

圖4 各組腎臟組織TGF-β1基因表達(dá)變化

與正常對(duì)照組比較，*P < 0.05；與模型組比較，#P < 0.05

圖5 各組腎臟組織collagen-1基因表達(dá)變化

表2 各組CTGF、TGF-β1、collagen-1基因表達(dá)情況（x±s）

注：與正常對(duì)照組比較，*P < 0.05；與模型組比較，#P < 0.05；TGF-β1：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1；collagen-1：重組人膠原蛋白-1；CTGF：結(jié)締組織生長(zhǎng)因子

3 討論

TGF-β1是一種廣泛分布于多種細(xì)胞組織中的多肽類(lèi)調(diào)控蛋白，在腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化發(fā)生、發(fā)展中起作用，被認(rèn)為是誘導(dǎo)腎小管間質(zhì)纖維化的重要細(xì)胞因子之一[4-5]。腎小管間質(zhì)纖維化以過(guò)量細(xì)胞外基質(zhì)在正常腎小管和腎間質(zhì)聚集為特征，被認(rèn)為是各種不同病因所致慢性腎臟疾病進(jìn)展至終末期腎衰竭的共同病理途徑。腎小管間質(zhì)纖維化的早期防治對(duì)腎臟疾病轉(zhuǎn)歸有重要意義[6]。

CTGF是抗纖維化作用因子之一，是一種富含半胱氨酸的多肽[7]。Bradham等[8]于1991年首次發(fā)現(xiàn)了這種細(xì)胞因子。據(jù)研究，在生理狀態(tài)時(shí)，腎間質(zhì)內(nèi)有少量CTGF，在某些病理狀態(tài)下，CTGF表達(dá)量顯著增加。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也表明，各種纖維化疾病模型中，CTGF的表達(dá)都顯著升高[9]。CTGF生物學(xué)效應(yīng)較為單一，因此阻斷CTGF表達(dá)或抑制其活性，可能是一種預(yù)防纖維化的有效手段[10-12]。

近年來(lái)維生素D，尤其是其活性代謝產(chǎn)物活性維生素D[1，25-（OH）2D3]對(duì)糖尿病腎病的腎臟保護(hù)作用備受關(guān)注。有研究表明，維生素D主要是減少腎臟足細(xì)胞肥大及丟失，進(jìn)而減輕蛋白尿及腎小球硬化[13]，抑制高糖誘導(dǎo)的血管緊張素原和腎素表達(dá)，繼而抑制細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，抑制白細(xì)胞介素（IL）-1、IL-6、腫瘤壞死因子-α等遞質(zhì)的作用，抑制TGF-β1、NF-κB、單核細(xì)胞趨化蛋白（MCP）-1等細(xì)胞因子的表達(dá)，抑制巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)等，抑制炎癥因子分泌，抑制系膜細(xì)胞增殖和保護(hù)足細(xì)胞等活性，對(duì)糖尿病大鼠腎臟損傷有預(yù)防保護(hù)作用[14]。

在本研究中可以發(fā)現(xiàn)，TGF-β1、CTGF、collagen-1在治療組中的基因表達(dá)量高于空白組，低于模型組（P < 0.05），提示糖尿病腎病大鼠的腎臟損傷可能與TGF-β1、CTGF、collagen-1相關(guān)。給予維生素D干預(yù)后，治療組的TGF-β1、CTGF、collagen-1基因的表達(dá)量明顯低于模型組，提示維生素D可能通過(guò)下調(diào)TGF-β1、CTGF、collagen-1基因的表達(dá)來(lái)發(fā)揮腎臟的保護(hù)作用。Tall等[15]的研究結(jié)果提示，CTGF可以被TGF-β1誘導(dǎo)表達(dá)，并作為T(mén)GF-β1主要的下游介質(zhì)介導(dǎo)其促纖維化作用。然而CTGF既可以被TGF-β1調(diào)節(jié)，同時(shí)又是TGF-β1的調(diào)節(jié)者。

通過(guò)光鏡不難看出，模型組與正常對(duì)照組相比存在更嚴(yán)重的腎小球硬化，表現(xiàn)為腎小球系膜區(qū)更多的細(xì)胞外基質(zhì)集聚，相比之下，治療組細(xì)胞外基質(zhì)集聚的量遠(yuǎn)小于模型組。電鏡下可見(jiàn)到模型組腎臟結(jié)構(gòu)的病理變化明顯，結(jié)構(gòu)不完整，局部可見(jiàn)到明顯的壞死脫落，治療組可以發(fā)現(xiàn)腎小管、腎小球結(jié)構(gòu)較模型組相比明顯好轉(zhuǎn)。進(jìn)一步驗(yàn)證了維生素D對(duì)糖尿病腎病的治療效果比較顯著。目前維生素D對(duì)糖尿病腎病發(fā)展的作用尚沒(méi)有報(bào)道，在后期的工作中可以以這點(diǎn)作為方向進(jìn)一步研究維生素D對(duì)糖尿病腎病發(fā)展的具體作用，為臨床工作打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Ma RC，Tam CH，Wang Y，et al. Genetic variants of the protein kinase C-β1 gene and development of end-stage renal disease in patients with type 2 diabetes [J]. JAMA，2010，304（8）：881-889.

[2]黃菊芳，廖志紅，肖海鵬，等.2009年首屆全國(guó)糖尿病及代謝性疾病與腎臟病學(xué)術(shù)會(huì)議實(shí)錄[J].中國(guó)處方藥，2009， 17（4）：54-55.

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[4]王曉虎，孫良閣.苯那普利對(duì)早期糖尿病腎病患者轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β、尿白蛋白排泄率的影響[J].中華實(shí)用診斷與治療雜志，2009，23（12）：1222-1223.

[5]郭艷萍，楊廣英，王建君，等.轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1及VEGF在肝纖維化中的表達(dá)[J].中華實(shí)用診斷與治療雜志，2008， 22（10）：724-725.

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[15]Tall EG，Bernstein AM，Oliver N，et al. TGF-β–Stimulated CTGF Production Enhanced by Collagen and Associated with Biogenesis of a Novel 31-kDa CTGF Form in Human Corneal Fibroblasts [J]. Investigative Ophthalmology & Visual Science，2010，51（10）：5002-5011.

（收稿日期：2014-03-03本文編輯：程銘）

[基金項(xiàng)目] 國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（編號(hào)81160116）。

[作者簡(jiǎn)介] 田燕燕（1965.6-），女，新疆烏魯木齊人，新疆醫(yī)科大學(xué)2011級(jí)內(nèi)分泌專(zhuān)業(yè)在讀碩士研究生；研究方向：內(nèi)分泌與基礎(chǔ)代謝。

[通訊作者] 朱筠（1966.7-），女，新疆烏魯木齊人，新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科主任；研究方向：內(nèi)分泌基礎(chǔ)研究。

endprint

圖2 各組腎小管及腎小球的電鏡觀(guān)察（6000×）

2.3 各組CTGF、TGF-β1、collagen-1基因表達(dá)情況

模型組CTGF、TGF-β1、collagen-1基因的表達(dá)量明顯高于正常對(duì)照組（P < 0.05）；治療組CTGF、TGF-β1、collagen-1基因表達(dá)量低于模型組（P < 0.05）。見(jiàn)表2、圖3~5。

與正常對(duì)照組比較，*P < 0.05；與模型組比較，#P < 0.05

圖3 各組腎臟組織CTGF基因表達(dá)變化

與正常對(duì)照組比較，*P < 0.05；與模型組比較，#P < 0.05

圖4 各組腎臟組織TGF-β1基因表達(dá)變化

與正常對(duì)照組比較，*P < 0.05；與模型組比較，#P < 0.05

圖5 各組腎臟組織collagen-1基因表達(dá)變化

表2 各組CTGF、TGF-β1、collagen-1基因表達(dá)情況（x±s）

注：與正常對(duì)照組比較，*P < 0.05；與模型組比較，#P < 0.05；TGF-β1：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1；collagen-1：重組人膠原蛋白-1；CTGF：結(jié)締組織生長(zhǎng)因子

3 討論

TGF-β1是一種廣泛分布于多種細(xì)胞組織中的多肽類(lèi)調(diào)控蛋白，在腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化發(fā)生、發(fā)展中起作用，被認(rèn)為是誘導(dǎo)腎小管間質(zhì)纖維化的重要細(xì)胞因子之一[4-5]。腎小管間質(zhì)纖維化以過(guò)量細(xì)胞外基質(zhì)在正常腎小管和腎間質(zhì)聚集為特征，被認(rèn)為是各種不同病因所致慢性腎臟疾病進(jìn)展至終末期腎衰竭的共同病理途徑。腎小管間質(zhì)纖維化的早期防治對(duì)腎臟疾病轉(zhuǎn)歸有重要意義[6]。

CTGF是抗纖維化作用因子之一，是一種富含半胱氨酸的多肽[7]。Bradham等[8]于1991年首次發(fā)現(xiàn)了這種細(xì)胞因子。據(jù)研究，在生理狀態(tài)時(shí)，腎間質(zhì)內(nèi)有少量CTGF，在某些病理狀態(tài)下，CTGF表達(dá)量顯著增加。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也表明，各種纖維化疾病模型中，CTGF的表達(dá)都顯著升高[9]。CTGF生物學(xué)效應(yīng)較為單一，因此阻斷CTGF表達(dá)或抑制其活性，可能是一種預(yù)防纖維化的有效手段[10-12]。

近年來(lái)維生素D，尤其是其活性代謝產(chǎn)物活性維生素D[1，25-（OH）2D3]對(duì)糖尿病腎病的腎臟保護(hù)作用備受關(guān)注。有研究表明，維生素D主要是減少腎臟足細(xì)胞肥大及丟失，進(jìn)而減輕蛋白尿及腎小球硬化[13]，抑制高糖誘導(dǎo)的血管緊張素原和腎素表達(dá)，繼而抑制細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，抑制白細(xì)胞介素（IL）-1、IL-6、腫瘤壞死因子-α等遞質(zhì)的作用，抑制TGF-β1、NF-κB、單核細(xì)胞趨化蛋白（MCP）-1等細(xì)胞因子的表達(dá)，抑制巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)等，抑制炎癥因子分泌，抑制系膜細(xì)胞增殖和保護(hù)足細(xì)胞等活性，對(duì)糖尿病大鼠腎臟損傷有預(yù)防保護(hù)作用[14]。

在本研究中可以發(fā)現(xiàn)，TGF-β1、CTGF、collagen-1在治療組中的基因表達(dá)量高于空白組，低于模型組（P < 0.05），提示糖尿病腎病大鼠的腎臟損傷可能與TGF-β1、CTGF、collagen-1相關(guān)。給予維生素D干預(yù)后，治療組的TGF-β1、CTGF、collagen-1基因的表達(dá)量明顯低于模型組，提示維生素D可能通過(guò)下調(diào)TGF-β1、CTGF、collagen-1基因的表達(dá)來(lái)發(fā)揮腎臟的保護(hù)作用。Tall等[15]的研究結(jié)果提示，CTGF可以被TGF-β1誘導(dǎo)表達(dá)，并作為T(mén)GF-β1主要的下游介質(zhì)介導(dǎo)其促纖維化作用。然而CTGF既可以被TGF-β1調(diào)節(jié)，同時(shí)又是TGF-β1的調(diào)節(jié)者。

通過(guò)光鏡不難看出，模型組與正常對(duì)照組相比存在更嚴(yán)重的腎小球硬化，表現(xiàn)為腎小球系膜區(qū)更多的細(xì)胞外基質(zhì)集聚，相比之下，治療組細(xì)胞外基質(zhì)集聚的量遠(yuǎn)小于模型組。電鏡下可見(jiàn)到模型組腎臟結(jié)構(gòu)的病理變化明顯，結(jié)構(gòu)不完整，局部可見(jiàn)到明顯的壞死脫落，治療組可以發(fā)現(xiàn)腎小管、腎小球結(jié)構(gòu)較模型組相比明顯好轉(zhuǎn)。進(jìn)一步驗(yàn)證了維生素D對(duì)糖尿病腎病的治療效果比較顯著。目前維生素D對(duì)糖尿病腎病發(fā)展的作用尚沒(méi)有報(bào)道，在后期的工作中可以以這點(diǎn)作為方向進(jìn)一步研究維生素D對(duì)糖尿病腎病發(fā)展的具體作用，為臨床工作打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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[9]Letterio JJ，Bottinger EP. TGF-bet a knockout and dominant2negative receptor transgenic mice [J]. Miner Electrolyte Metab，1998，24（2-3）：161-167.

[10]Bikle D. Nonclassic actions of vitamin D [J]. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism，2009，94（1）：26-34.

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[13]Nagpal S，Na S，Rathnachalam R. Noncalcemic actions of vitamin D receptor ligands [J]. Endocrine Reviews，2005， 26（5）：662-687

[14]馬麗娟，杜國(guó)利，趙琦英，等.活性維生素D3對(duì)大鼠早期糖尿病腎病相關(guān)炎性因子的影響[J].中華實(shí)用診斷與治療雜志，2012，26（3）：234-237.

[15]Tall EG，Bernstein AM，Oliver N，et al. TGF-β–Stimulated CTGF Production Enhanced by Collagen and Associated with Biogenesis of a Novel 31-kDa CTGF Form in Human Corneal Fibroblasts [J]. Investigative Ophthalmology & Visual Science，2010，51（10）：5002-5011.

（收稿日期：2014-03-03本文編輯：程銘）

[基金項(xiàng)目] 國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（編號(hào)81160116）。

[作者簡(jiǎn)介] 田燕燕（1965.6-），女，新疆烏魯木齊人，新疆醫(yī)科大學(xué)2011級(jí)內(nèi)分泌專(zhuān)業(yè)在讀碩士研究生；研究方向：內(nèi)分泌與基礎(chǔ)代謝。

[通訊作者] 朱筠（1966.7-），女，新疆烏魯木齊人，新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科主任；研究方向：內(nèi)分泌基礎(chǔ)研究。

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