茵陳蒿水提液對腦出血大鼠TNF-a、IL-1β表達(dá)的研究

李培育，和 梅，左寒璐

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江佳木斯154003)

茵陳蒿［1，2］為多年生草本艾科植物，目前對其治療腦出血具體機(jī)制方面的研究報(bào)道很少。腫瘤壞死因子 α［3～5］(Tumor necrosis factor TNF-a)各種病因所致腦水腫均可觀察到TNF-a的過度表達(dá)。腦出血時(shí)局部腦組織釋放促凝血酶原激酶，激活補(bǔ)體的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，生成C5a，在C5a存在的情況下，巨噬細(xì)胞被激活產(chǎn)生TNF-a。細(xì)胞因子中白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-1βIL-1β)是一種重要的炎性細(xì)胞因子，IL-1β［6，7］可能參與了缺血性腦損傷引起的神經(jīng)元的死亡，在缺血性病理損傷中起重要的作用。其可以通過刺激內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)白細(xì)胞黏附分子，使白細(xì)胞聚集在缺血腦組織，加重腦組織損害。本文旨在研究茵陳蒿水提液對腦出血模型大鼠腦出血周圍組織IL-1β、TNF-a的表達(dá)的影響，為茵陳蒿提取液在臨床的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持，讓其更廣泛地應(yīng)用于腦出血患者。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

純系Wistar大鼠100只，雌性50只，雄性50只，2～3月齡，體重200～250g，由佳木斯大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)中藥

茵陳蒿由藥店采購，經(jīng)鑒定符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。RT-PCR試劑盒(大連寶生物有限公司)；TNF-a免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；IL-1β免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；SABC試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

將100只Wistar大鼠隨機(jī)分成4組，即正常對照組、創(chuàng)傷模型組、低劑量組(50mg/kg·d)、高劑量組(150mg/kg·d)，參照 Rosenberg等［8］報(bào)道的方法采用注射膠原酶Ⅶ造模。模型成功判斷按Bederson［42］的評定方法分成三級(jí)，具體為：I級(jí)：將大鼠尾巴提起癱瘓側(cè)前肢回收屈曲于腹下，正常側(cè)前肢向地面伸展；Ⅱ級(jí)：除I級(jí)體征外向癱瘓側(cè)推大鼠時(shí)阻力較對側(cè)明顯降低；Ⅲ級(jí)：除以上體征外大鼠有向癱瘓側(cè)旋轉(zhuǎn)的行為。茵陳蒿水提液高、低劑量組于造模后立即灌胃給藥。高劑量組0.1mL/g·d，低劑量組0.05mL/g·d，均每日分兩次灌服，用藥到相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)。ICH對照組：造模后立即灌服等體積生理鹽水，與用藥組時(shí)間相同。于造模成功后1d、3d、7d分時(shí)間點(diǎn)處死，取動(dòng)物出血部位腦組織進(jìn)行實(shí)驗(yàn)檢測。

1.4 檢測方法

免疫組織化學(xué)法檢測肝組織TNF-a、IL-1β，按試劑盒說明書操作。用β-actin作為內(nèi)參。按照按PCR試劑盒說明操作。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，進(jìn)行方差分析、組間差異性檢驗(yàn)用q檢驗(yàn)。以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。

2 結(jié)果

2.1 IL-1β免疫組化結(jié)果

見表1。

表1 各組間不同時(shí)間點(diǎn)IL-1β顯色指數(shù)()

表1 各組間不同時(shí)間點(diǎn)IL-1β顯色指數(shù)()

注：各組與正常組比*P ＜0.05，＊＊P＜0.01。與模型組相比#P＜0.05，與模型組相比## P＜0.01，與低劑量組相比＆P＜0.05

組別1d 3d 7d正常組6.63±0.31 8.26±0.22 4.32±0.12模型組 92.33±3.52＊＊ 84.26±2.71＊＊ 70.43±3.35*低劑量組 84.54±4.13＊＊ 74.63±3.15* 60.54±2.53*#高劑量組 77.37±3.72* 54.65±3.28*# 35.55±2.02＊＊##＆

治療1d后正常對照組比較模型組IL-1β免疫組織化學(xué)顯色指數(shù)明顯升高(P＜0.01)；高劑量組低劑量組顯色指數(shù)與模型組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。治療3d后正常對照組比較模型組IL-1β免疫組織化學(xué)顯色指數(shù)明顯升高(P＜0.01)，治療高、低劑量組IL-1β顯色指數(shù)明顯低于模型組(P＜0.05)，高、低劑量組之間無顯色指數(shù)無差異(P＞0.05)；治療7d后正常對照組比較模型組IL-1β免疫組織化學(xué)顯色指數(shù)明顯升高(P＜0.01)，治療高、低劑量組IL-1β顯色指數(shù)明顯低于模型組(P＜0.05或P＜0.01)，高劑量組IL-1β顯色指數(shù)明顯低于低劑量組(P＜0.05)。

2.2 TNF-a免疫組化結(jié)果

見表2。

表2 各組間TNF-a顯色指數(shù)比較(x± s，%)

治療1d后正常對照組比較模型組TNF-a免疫組織化學(xué)顯色指數(shù)明顯升高(P＜0.01)；高劑量組、低劑量組顯色指數(shù)與模型組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。治療3d后正常對照組比較模型組TNF-a免疫組織化學(xué)顯色指數(shù)明顯升高(P＜0.01)，治療高、低劑量組TNF-a顯色指數(shù)明顯低于模型組(P＜0.05)，高、低劑量組之間無顯色指數(shù)無差異(P＞0.05)。

2.3 RT-PCR結(jié)果

2.3.1 茵陳蒿水提液對大鼠血腫周圍腦組織IL-1βmRNA表達(dá)的結(jié)果，見表3。

表3 茵陳蒿水提液對大鼠血腫周圍腦組織IL-1βmRNA表達(dá)的影響(n=8)

治療1d后腦出血模型組大鼠腦血腫周圍組織IL-1β mRNA表達(dá)水平比正常對照組明顯增多，茵陳蒿水提液高劑量組、低劑量組大鼠腦血腫周圍組織IL-1βmRNA表達(dá)水平較模型組無明顯差異，結(jié)果無著性意義。治療3d后腦出血模型組大鼠腦血腫周圍組織IL-1βmRNA表達(dá)水平比正常對照組明顯增多，茵陳蒿水提液高劑量組、低劑量組大鼠腦血腫周圍組織IL-1βmRNA表達(dá)水平較模型組下調(diào)，差異有極顯著性意義(P＜0.05)。提示茵陳蒿水提液高、低劑量在治療3d后可降低大鼠腦血腫周圍組織IL-1βmRNA表達(dá)。治療7d后茵陳蒿水提液高劑量組、低劑量組大鼠腦血腫周圍組織IL-1βmRNA表達(dá)水平較模型組下調(diào)，差異有極顯著性意義(P＜0.05或P＜0.01)。提示茵陳蒿水提液高、低劑量在治療7d后可降低大鼠腦血腫周圍組織IL-1βmRNA表達(dá)。

2.3.2 茵陳蒿水提液對大鼠血腫周圍腦組織TNF-αmRNA表達(dá)的結(jié)果，見表4。

表4 茵陳蒿水提液對大鼠血腫周圍腦組織TNF-αmRNA表達(dá)的影響(n=8)

治療1d后腦出血模型組大鼠腦血腫周圍組織TNF-α mRNA表達(dá)水平比正常對照組明顯增多，茵陳蒿水提液高劑量組、低劑量組大鼠腦血腫周圍組織TNF-αmRNA表達(dá)水平較模型組無明顯差異，結(jié)果無著性意義。治療3d后茵陳蒿水提液高劑量組、低劑量組大鼠腦血腫周圍組織TNF-α mRNA表達(dá)水平較模型組下調(diào)，結(jié)果有著性意義(P＜0.05)。高劑量組與低劑量組TNF-αmRNA表達(dá)無顯著意義。治療7d后茵陳蒿水提液高劑量組、低劑量組大鼠腦血腫周圍組織TNF-αmRNA表達(dá)水平較模型組下調(diào)，差異有極顯著性意義(P＜0.05或P＜0.01)。提示茵陳蒿水提液高、低劑量在治療7d后可降低大鼠腦血腫周圍組織IL-1βmRNA表達(dá)。茵陳蒿水提液高劑量組IL-1βmRNA表達(dá)較低劑量下調(diào)，差異有顯著意義(P＜0.05)。

3 討論

在腦出血中，炎癥反應(yīng)是其中的重要環(huán)節(jié)，在引起腦血腫占位效應(yīng)的同時(shí)還可以繼發(fā)破壞周圍組織。引起一系列反應(yīng)進(jìn)而加重組織損害。IL-1β炎癥反應(yīng)中的關(guān)鍵因子，它是由腦實(shí)質(zhì)內(nèi)的炎癥細(xì)胞激活腦神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞因子，它可以激活過釋放脂源性介質(zhì)促進(jìn)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，進(jìn)而產(chǎn)生氧自由基，用來破壞神經(jīng)元的細(xì)胞膜加重腦組織壞死，同時(shí)IL-1β能釋放大量毒性產(chǎn)物和破壞性蛋白酶，致使神經(jīng)細(xì)胞遭到損害［9，10］。

TNF-α是一種炎癥前體細(xì)胞因子，在炎癥反應(yīng)中起著重要作用［11］。它可以促進(jìn)IL-1分泌，還能促進(jìn)白細(xì)胞分泌，同時(shí)參與炎癥損傷的過程，TNF-α、IL-1β也可誘導(dǎo)趨化因子(chemokines)表達(dá)“趨化因子可直接或間接誘導(dǎo)另一些細(xì)胞的活動(dòng)，為炎癥細(xì)胞直接進(jìn)入損傷組織提供化學(xué)梯度”，加重炎癥反應(yīng)，破壞腦組織。

在本實(shí)驗(yàn)中，造模后1d模型組大鼠腦血腫周圍組織的TNF-α、IL-1β免疫組化顯色指數(shù)均較正常對照組明顯上調(diào)(P＜0.05或P＜0.01)；模型組大鼠腦血腫周圍組織TNF-α、IL-1β的 mRNA表達(dá)也均較正常組上調(diào)(P＜0.05或P＜0.01)。

從以上結(jié)果表明，茵陳蒿水提液可以對腦出血的大鼠有一定的治療作用，其可能的的機(jī)制為抑制IL-1β、TNF-α的表達(dá)，從而減輕炎癥反應(yīng)，減小對腦組織的傷害來實(shí)現(xiàn)，在治療的3d后高劑量組和低劑量組IL-1β、TNF-αmRNA及蛋白表達(dá)無明顯差異性(P＞0.05)。隨著治療時(shí)間的延長發(fā)現(xiàn)，治療7d后高劑量組IL-1β、TNF-αmRNA及蛋白表達(dá)較模型、正常組、低劑量組明顯增高。因此可以說明隨著治療時(shí)間的延長，茵陳蒿水提液高劑量的治療效果較低劑量效果要好。

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