KA2012MBL復合提取液體外抗腫瘤活性評價及相關(guān)機制研究

易翠林，時京杰，包 雪，王玉林

(1.大連活爾生物科技有限公司，遼寧大連 116023;2大連藍德奧科技有限公司，遼寧大連 116023;3.大連醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，遼寧大連 116044)

KA2012MBL復合提取液體外抗腫瘤活性評價及相關(guān)機制研究

易翠林1，時京杰2，包 雪3，王玉林3

(1.大連活爾生物科技有限公司，遼寧大連 116023;2大連藍德奧科技有限公司，遼寧大連 116023;3.大連醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，遼寧大連 116044)

目的 系統(tǒng)評價KA2012MBL復合提取液的抗腫瘤活性及對P-gp介導的腫瘤多藥耐藥的克服能力，并初步探討KA2012MBL復合提取液的抗腫瘤機制。方法 應(yīng)用SRB法測定KA2012MBL復合提取液對K562/A、K562/S和HGC-27的細胞毒活性，應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測KA2012MBL復合提取液對K562/S細胞的細胞周期阻滯作用、凋亡誘導作用和對其線粒體膜電位的影響作用。結(jié)果 KA2012MBL復合提取液對腫瘤細胞株K562/A、K562/S和 HGC -27 均具有細胞毒活性，IC50值分別為(1.12±0.15)%(v/v%)、(1.18±0.04)%(v/v%)、(1.21 ±0.17)%(v/v%)，并可有效克服P-gp介導的腫瘤多藥耐藥。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示KA2012MBL復合提取液可有效降低K562/S細胞的線粒體膜電位，并可使K562/S細胞阻滯在 G0/G1期，從而誘導其凋亡。結(jié)論KA2012MBL復合提取液通過誘導腫瘤細胞凋亡而殺死腫瘤細胞，同時能克服P-gp介導的腫瘤多藥耐藥。

細胞毒;腫瘤多藥耐藥;細胞周期;線粒體膜電位;細胞凋亡

腫瘤是危害人類健康的主要疾病之一，化療是中晚期惡性腫瘤病人最常用的治療方法。腫瘤細胞對抗腫瘤藥物的多藥耐藥(multidrug-resistance，MDR)是導致化療失敗的主要原因［1］。P-gp介導的多藥耐藥是腫瘤細胞MDR的主要機制之一［1］。此外，目前臨床使用的化療藥物均具有嚴重的毒副作用，因此導致其臨床治療效果不夠理想。而源自蔬菜、水果或海產(chǎn)品的抗腫瘤活性物質(zhì)一般對人體毒性較低或無毒性，而且其中有些可以有效克服腫瘤多藥耐藥。因此，該類藥物正在成為抗腫瘤藥物研發(fā)領(lǐng)域的熱點［2］。

KA2012MBL復合提取液是以牡蠣肉為主料，配以黃芪、枸杞、植物源維生素C為輔料，應(yīng)用獨特的細胞平衡液制備技術(shù)制備而成的。其含有人體所需的多種氨基酸、植物多糖、牛磺酸、維生素、微量元素及其他生物活性物質(zhì)。前期免疫調(diào)節(jié)實驗發(fā)現(xiàn)，KA2012MBL復合提取液對小鼠細胞免疫功能(DTH)和ConA刺激的T淋巴細胞增殖有明顯的增強作用;對巨噬細胞功能(碳粒廓清)有促進作用。因此具有顯著增強免疫力功效。而該復合提取液對腫瘤細胞的直接殺傷作用及機理尚有待研究。

本文系統(tǒng)評價了KA2012MBL復合提取液在體外對不同腫瘤細胞株的細胞毒活性及對P-gp介導的腫瘤多藥耐藥的克服能力，并對其抗腫瘤機理進行了初步研究，為該復合提取液的深度開發(fā)提供科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

人白血病細胞株K562/A(耐藥株)、K562/S(敏感株)(天津血研所);人胃癌細胞株HGC-27(上海細胞庫);KA2012MBL(藍德奧公司);RPMI-1640(Gibco);胎牛血清(杭州四季青);Trichloroacetic acid(Sigma);Tris-Base(Amresco);乙酸(分析純)(天津);Apoptosis Kit(Biouniquer);RNase A(Sigma);酶標儀(PerkinElmer/EnSpire2300_001M);96孔板(Costar);6孔板(Costar);Sulforhodamine B(Sigma);FACS(BD FACSCalibur);Rhodamine123(Sigma);離心機(Thermo ST16R);離心機(湘儀H2050R)。

1.2 方 法

1.2.1 細胞培養(yǎng):培養(yǎng)基為含10%小牛血清PRMI 1640培養(yǎng)液、37℃、5%CO2濕潤條件下培養(yǎng)，每隔2～3 d傳代1次。

1.2.2 SRB法測定KA2012MBL復合提取液對人白血病細胞株K562/A(耐藥株)、K562/S(敏感株)和人胃癌細胞株HGC-27的IC50:向96孔板內(nèi)加入倍比稀釋的 KA2012MBL復合提取液(100 μL/孔)，設(shè)2個重復孔。然后加100 μL細胞懸液(細胞濃度:6×104cells/mL)到96孔板;空白孔為100 μL 1640和100 μL培養(yǎng)基;同時設(shè)立無藥物對照孔:100 μL 1640加 100 μL細胞懸液。培養(yǎng) 44 h后，離心 3000 r/min，10 min，去上清，加入冷 16%trichloroacetic acid(100 μL/孔)4 ℃固定0.5 h，自來水沖洗5次，自然涼干。每孔加40 μL 0.4%SRB(1%乙酸溶液)染色45 min。用1%乙酸溶液洗4次，涼干后每孔加 100 μL 10 mmol/L Trisbase(pH10.0)溶解 SRB，震蕩10 min，用酶標儀測定吸光度(檢測波長為570 nm)。生存率計算方法:生存率(survival rate)=(T-B)/(U-B)×100%，T為藥物作用下細胞孔的吸光度，U為無藥物對照孔的吸光度，B為空白孔吸光度。將藥物濃度和對應(yīng)濃度下細胞的生存率應(yīng)用Sigmoid方程進行回歸分析，求得藥物對細胞的IC50。本研究以阿霉素為P-gp底物藥物陽性對照，分別測定阿霉素對K562/A(耐藥株)K562/S(取感株)的IC50。

1.2.3 流式細胞術(shù)測定凋亡:K562/S細胞(細胞濃度:6×104cells/mL)與終濃度為0.62%(v/v%)的KA2012MBL復合提取液作用48 h(注:該濃度為經(jīng)預(yù)實驗優(yōu)化后所得濃度)，同時設(shè)立無藥對照孔。然后收集細胞，離心2000 g/min，5 min，PBS洗滌2遍后收集細胞，加入500 μL Annexin V Binding Buffer重懸細胞，加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，加入5 μL Propidium Iodide混勻，避光，室溫反應(yīng)10 min，應(yīng)用流式細胞儀檢測，激發(fā)波長為488 nm，檢測波長為530 nm。

1.2.4 流式細胞術(shù)測定線粒體膜電位:K562/S細胞(細胞濃度:6×104cells/mL)與終濃度為0.62%(v/v%)的KA2012MBL復合提取液作用48 h(注:該濃度為經(jīng)預(yù)實驗優(yōu)化后所得濃度)，同時設(shè)立無藥對照孔。然后收集細胞，離心2000 g/min，5 min，PBS洗滌2遍后收集細胞，用500 μL PBS溶液重懸細胞后，加入 5 μL 892 μmol/L Rhodamine123(終濃度:8.92 μmol/L)后放入37℃水浴鍋中，溫浴30 min。離心2000 r/min，5 min，PBS洗2遍后收集細胞，用500 μL PBS溶液重懸細胞，應(yīng)用流式細胞儀檢測，激發(fā)波長為488 nm，檢測波長為530 nm。

1.2.5 流式細胞術(shù)測定細胞周期:K562/S細胞(細胞濃度:6×104cells/mL)與終濃度為0.62%(v/v%)的KA2012MBL復合提取液作用48 h(注:該濃度為經(jīng)預(yù)實驗優(yōu)化后所得濃度)，同時設(shè)立無藥對照孔。然后收集細胞，離心2000 g/min，5 min，PBS洗滌2遍，用10 mL 70%乙醇(-20℃預(yù)冷)重懸細胞后置于4℃過夜。離心2000 g/min，5 min，PBS洗滌2遍后收集細胞，用500 μL PBS重懸細胞后加入 5 μL 2 μg/μL RNase A(終濃度:20 μg/mL)，放入37℃水浴鍋中，溫浴30 min，加入5 μL Propidium Iodide混勻后，放入37℃水浴鍋中，避光，溫浴30 min，應(yīng)用流式細胞儀檢測，激發(fā)波長為488 nm，檢測波長為530 nm。

2 結(jié)果

2.1 KA2012MBL復合提取液對腫瘤細胞的細胞毒活性及對P-gp介導的腫瘤多藥耐藥的克服能力

按照細胞毒實驗標準操作規(guī)程，不同濃度KA2012MBL復合提取液分別與K562/S和HGC-27細胞作用44 h，然后應(yīng)用SRB法檢測該復合提取液的細胞毒活性，即 IC50值。結(jié)果顯示，KA2012MBL復合提取液對K562/S和HGC-27細胞的 IC50值分別為(1.18 ±0.04)%(v/v%)和(1.21±0.17)%(v/v%)。結(jié)果說明 KA2012MBL復合提取液具有良好的體外抗腫瘤活性。然后，本研究又測定KA2012MBL復合提取液對K562/A細胞的 IC50值，通過該復合提取液對 K562/A和K562/S的IC50值對該復合提取液對P-gp介導的腫瘤多藥耐藥的克服能力進行評價。同時測定P-gp底物類化療藥物阿霉素對K562/A和K562/S的IC50值作為P-gp介導的腫瘤細胞多藥耐藥的陽性對照。結(jié)果顯示，KA2012MBL復合提取液對K562/A和K562/S的IC50值非常接近，分別為1.12%(v/v%)和1.18%(v/v%)。而P-gp底物類化療藥物阿霉素對K562/A的IC50值遠遠高于其對K562/S的IC50值，前者的IC50值約為后者的6.12倍。結(jié)果說明KA2012MBL復合提取液中抗腫瘤活性成分可有效克服P-gp介導的腫瘤細胞多藥耐藥。見圖1。

圖1 應(yīng)用SRB法測定KA2012MBL復合提取液對K562/A和K562/S的細胞毒活性Fig 1 Cytotoxicity of KA2012MBL against K562/A and K562/S by SRB assay

2.2 KA2012MBL復合提取液對 K562/S細胞線粒體膜電位的影響

向6孔板每孔加入3 mL K562/S細胞(細胞濃度:6×104cells/mL)。在此細胞濃度條件下，K562/S細胞的傳代時間為48 h。故將K562/S細胞和0.62%(v/v%)KA2012MBL復合提取液相互作用48 h，同時設(shè)立無藥物對照孔，然后應(yīng)用流式細胞儀測定KA2012MBL復合提取液對K562/S線粒體膜電位的影響作用。結(jié)果顯示，KA2012MBL復合提取液可使K562/S細胞線粒體膜電位顯著降低。見圖2。

2.3 KA2012MBL復合提取液對K562/S細胞周期的阻滯作用

向6孔板每孔加入3 mL K562/S細胞(細胞濃度:6×104cells/mL)。在此細胞濃度條件下，K562/S細胞的傳代時間為48 h。故將K562/S細胞和0.62%(v/v%)KA2012MBL復合提取液相互作用48 h，同時設(shè)立無藥物對照孔，然后應(yīng)用流式細胞儀測定KA2012MBL復合提取液對K562/S細胞周期的影響作用。結(jié)果顯示，相比于無藥物對照組，KA2012MBL復合提取液實驗組中處于G0/G1期和S期的細胞比率顯著增多，而處于G2期細胞的比率則明顯減少。說明KA2012MBL復合提取液G2期進行分裂，從而阻止其增殖。見圖3。

2.4 KA2012MBL復合提取液對K562/S細胞凋亡的誘導作用

向6孔板每孔加入3 mL K562/S細胞(細胞濃度:6×104cells/mL)。在此細胞濃度條件下，K562/S細胞的傳代時間為48 h。故將K562/S細胞和1.6%(v/v%)KA2012MBL復合提取液相互作用48 h，同時設(shè)立無藥物對照孔，然后用Annexin V-FITC和Propidium Iodide染色后應(yīng)用流式細胞儀進行細胞凋亡檢測。結(jié)果顯示，KA2012MBL復合提取液作用后，17.2%的K562/S細胞出現(xiàn)凋亡，其中早期凋亡細胞占細胞總數(shù)的2.42%，晚期凋亡細胞占細胞總數(shù)的14.82%。見圖4。

圖3 應(yīng)用流式細胞術(shù)分析樣品B對K562/S周期的誘導作用Fig 3 Cell cycle arrest activity of KA2012MBL on K562/S cells by FACS analysis

圖4 應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測KA2012MBL復合提取液對K562/S凋亡的誘導作用Fig 4 Apoptosis induction activity of KA2012MBL on K562/S cells by FACS analysis

3 討論

開發(fā)具有高生物活性、低毒副作用并可有效克服腫瘤多藥耐藥的抗腫瘤藥物是目前抗腫瘤藥物研發(fā)領(lǐng)域的熱點［2］。本文研究發(fā)現(xiàn)，KA2012MBL復合提取液對不同組織來源的腫瘤細胞株K562/S和HGC-27均具有細胞毒活性。同時本研究結(jié)果表明，KA2012MBL復合提取液不是通過物理損傷導致細胞死亡，而是通過與細胞內(nèi)特異性受體結(jié)合后，誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡，從而殺死腫瘤細胞。本文研究發(fā)現(xiàn)，KA2012MBL復合提取液與K562/S細胞作用48 h后，可導致K562/S細胞線粒體膜電位顯著降低。線粒體膜電位降低后，隨之呼吸鏈脫耦聯(lián)造成線粒體損傷，產(chǎn)生的活性氧類和多種促凋亡因子如凋亡誘導因子(AIF)、細胞素C等釋放到胞質(zhì)［3］。這些因子將激活相關(guān)凋亡通路，從而引發(fā)內(nèi)源性細胞凋亡［4-5］。據(jù)報道，在體外可以引發(fā)腫瘤細胞凋亡的抗腫瘤活性物質(zhì)，其在體內(nèi)殺死腫瘤細胞的活性均比較理想，從而成為抗腫瘤新藥的可能性要遠遠高于其他在體外具有抗腫瘤活性的物質(zhì)［6］。此外，細胞凋亡與細胞周期變化密切相關(guān)［7-10］。細胞增殖經(jīng)過G0/G1-S-G2-M四個時期，本文研究發(fā)現(xiàn)，K562/S細胞與KA2012MBL復合提取液作用后，G2/M期細胞比例顯著減少，并伴隨處于G0/G1前的亞二倍體(DNA 碎片［10-11］)增多，說明 K562/S細胞被阻滯在G0/G1期而無法進入G2/M期，從而導致S期和G0/G1期細胞比例相對增加。因細胞周期被阻滯，所以細胞周期相對延長，由此將導致細胞走向凋亡［11-12］。

K562/A細胞株源自K562/S，兩株細胞的主要區(qū)別在于K562/A為P-gp高表達，而K562/S為P-gp低表達株［13］。如果一種抗腫瘤藥物對K562/A的IC50值顯著高于其對于K562/S的IC50值，則說明該抗腫瘤藥物是P-gp的底物，無法克服P-gp介導的MDR，無開發(fā)前景。KA2012MBL復合提取液對K562/A和K562/S的 IC50無明顯差異，提示KA2012MBL復合提取液中的抗腫瘤活性成分不是P -gp 的底物［1，10-11］，即 KA2012MBL 復合提取液可有效克服P-gp介導的腫瘤多藥耐藥，具有良好的開發(fā)前景。

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Antitumor activity and mechanism of KA2012MBL in vitro

YI Cui-lin1，SHI Jing-jie2，BAO Xue3，WANG Yu-lin3
(1.Dalian Higher Bio Tec Co.Ltd，Dalian116023，China;2.Dalian Landauer Co.Ltd，Dalian116023，China;3.Department of Parasitology，Dalian Medical University，Dalian116044，China)

［Abstract］ObjectiveTo evaluate the antitumor activity of KA2012MBL and the ability to overcome P-gp mediated MDRin vitro.MethodsThe cytotoxicity of KA2012MBL against K562/A，K562/S and HGC-27 were determined by SRB assay.FACS analysis was used to detect the cell cycle arrest activity and apoptosis induction activity of KA2012MBL on K562/S cells and the loss of mitochondria membrane potential(MMP)of K562/S cells caused by KA2012MBL.ResultsKA2012MBL showed excellentin vitrocytotoxicity against K562/A，K562/S and HGC -27，with IC50of(1.12 ±0.15)%(v/v%)，(1.18 ±0.04)%(v/v%)and(1.21 ±0.17)%(v/v%)，respectively.It also shows ability to overcome P - gp mediated MDR.Furthermore，KA2012MBL caused the loss of MMP of K562/S cells and cell cycle arrest at G0/G1phase，and induced the apoptosis of K562/S cells.ConclusionKA2012MBL exerts its antitumor activity by apoptosis induction in tumor cells，which indicates KA2012MBL would show very potent in vivo antitumor activity.Furthermore，KA2012MBL could overcome P-gp mediated MDR successfully.

［Key words］SRB;cytotoxicity;cell life-cycle;mitochondria membrane potential;apoptosis

R979.1+9

A

1671-7295(2014)01-0018-05

易翠林，時京杰，包雪，等.KA2012MBL復合提取液體外抗腫瘤活性評價及相關(guān)機制研究［J］.大連醫(yī)科大學學報，2014，36(1):18 -22.

10.11724/jdmu.2014.01.05

易翠林(1964-)，女，德國萊茵蘭-法爾茨州蘭道市人，博士。E-mail:cuilinyi2008@163.com

王玉林，副教授。E-mail:wangyulin1971@126.com

2013-11-11;

2013-12-05)