馬錢(qián)子堿固體脂質(zhì)納米粒大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究

趙義軍，呂邵娃，古立翠，管慶霞，張 亮，李永吉，高佳翔，張欣媛

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，哈爾濱 150040)

馬錢(qián)子堿(Brucine)為馬錢(qián)科植物馬錢(qián)子(Strychons nuxvanica L.)的主要有效成分，為吲哚型的生物堿，具有抗癌、鎮(zhèn)痛、促進(jìn)骨修復(fù)及增強(qiáng)機(jī)體免疫力等作用，是極具研究潛力的抗腫瘤藥物，但其體內(nèi)消除半衰期短，具有明顯的中樞毒性.固體脂質(zhì)納米粒(SLN)是一種以固體脂質(zhì)為粒子基質(zhì)，粒徑在納米范圍內(nèi)的新型藥物傳遞系統(tǒng)[1]，粒徑小，生物毒性低，具有控釋和長(zhǎng)效制劑的優(yōu)勢(shì).本文在馬錢(qián)子堿固體脂質(zhì)納米粒制備工藝研究的基礎(chǔ)上，對(duì)馬錢(qián)子堿固體脂質(zhì)納米粒(B-SLN)的體內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究，并與馬錢(qián)子堿單體溶液的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)相比較，為馬錢(qián)子堿納米制劑的研究提供科學(xué)依據(jù).

1 儀器與試劑

1.1 儀器

美國(guó)Waters公司高效液相色譜儀系統(tǒng)：2996Photodiode Array Detector，2695Separations Module， Empow色譜工作站；色譜柱Diamonsi (R) 鉆石C18(250×4.6 μm，5 μm)；TGL-16C型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；WH-1微型渦旋混合器(上海滬西分析儀器廠有限公司)；微量移液器(大龍合資)；MP2000電子天平(上海第二天平儀器廠)；BCD-221B/HC RONGSHENG冰箱；氮吹儀(BF-2000).

1.2 試劑

馬錢(qián)子堿對(duì)照品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；PoLoxamer 188(批號(hào)WPOG565B，上海宏運(yùn)化工有限公司)；卵磷脂(批號(hào)20101103，上海靈錦精細(xì)化工有限公司)；單硬脂酸甘油酯(批號(hào)10517，阿拉丁化工有限公司)；二氯甲烷(天津化學(xué)試劑廠)；色譜甲醇(美國(guó)Dikma公司)；娃哈哈純凈水，其他試劑均為市售分析純.

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wistar大鼠，體重(200±10)g，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)GLP實(shí)驗(yàn)室提供，合格證號(hào)SYXK(黑)2012-001.

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Dikma C18ODS( 250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相：甲醇︰水-乙酸-三乙胺(30∶70);流速：1mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：264 nm; 進(jìn)樣量：20 μL.

2.2 血漿樣品處理

精密吸取100 μL血漿樣品置具塞試管中，加入50 μL的1 moL/L氫氧化鈉液，振搖混勻，渦旋5 min，冷水超聲20 min，取出，加入0.5 mL提取液(二氯甲烷∶甲醇=9∶1)，渦旋5 min，冷水超聲20 min，取出離心10 min(10 000 r/min)，分層，吸取下層液，再加0.5 mL提取液重新萃取1遍，合并兩次二氯甲烷層，在45 ℃氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)镉?00 μL甲醇溶解，渦旋3 min，離心15 min(12 000 r/min)，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣20 μL，HPLC分析記錄峰面積.

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍

精密吸取馬錢(qián)子堿系列標(biāo)準(zhǔn)溶液200 μL，置于1.5 mL離心管中，分別精密加入空白血漿100 μL，渦旋混合1 min后，按2.2項(xiàng)下方法處理，HPLC分析測(cè)定，進(jìn)樣量20 μL，記錄峰面積.以馬錢(qián)子堿的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，馬錢(qián)子堿的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.經(jīng)計(jì)算機(jī)線性回歸可知馬錢(qián)子堿的質(zhì)量濃度在0.60～38.40 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=13 535X+3 059.5，r2=0.999 1.

2.3.2 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

分別制備空白血漿，空白血漿加對(duì)照品、給藥后血漿，按2.2項(xiàng)下方法處理測(cè)定，進(jìn)樣20 μL，進(jìn)行HPLC分析，記錄色譜圖，將色譜圖相對(duì)照，結(jié)果表明在血漿樣品處理過(guò)程中未引入干擾性雜質(zhì)，且血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾測(cè)定.色譜圖見(jiàn)圖1.

圖1 樣品高效液相色譜圖

2.3.3 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取大鼠空白血漿100 μL，分別加入不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液200 μL，配制成相當(dāng)于質(zhì)量濃度為5.0、25.0、50.0 μg/mL的馬錢(qián)子堿樣品溶液，按2.2項(xiàng)下方法處理測(cè)定.每份樣品連續(xù)進(jìn)樣5次，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線將峰面積換算成馬錢(qián)子堿質(zhì)量濃度，計(jì)算日內(nèi)精密度；連續(xù)5 d相同條件進(jìn)樣，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線將峰面積換算成馬錢(qián)子堿質(zhì)量濃度，計(jì)算日內(nèi)和日間精密度.結(jié)果見(jiàn)表1.日內(nèi)精密度和日間精密度的RSD值均小于5%，精密度良好，符合生物樣品分析指導(dǎo)原則的要求.

表1 日內(nèi)、日間精密度結(jié)果

2.3.4 提取回收率

見(jiàn)表2.

表2 血漿中馬錢(qián)子堿的提取回收率(n=5)

精密吸取大鼠空白血漿100 μL，加入不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液200 μL，配制成相當(dāng)質(zhì)量濃度為5.0、25.0、50.0 μg/mL的馬錢(qián)子堿樣品溶液，按2.2項(xiàng)下方法處理測(cè)定，進(jìn)樣20 μL，進(jìn)行HPLC分析，記錄峰面積，每個(gè)質(zhì)量濃度平行作5份；另取質(zhì)量濃度為5.0、25.0、50.0 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行HPLC分析，記錄峰面積，每個(gè)質(zhì)量濃度平行作5份.上述計(jì)算方法回收率所記錄的峰面積與此次操作相應(yīng)質(zhì)量濃度的樣品的峰面積之比即得提取回收率，從而求得馬錢(qián)子堿的提取回收率.

2.3.5 方法回收率

精密吸取大鼠空白血漿100 μL，分別加入不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液200 μL，配制成相當(dāng)于質(zhì)量濃度為5.0、25.0、50.0 μg/mL的馬錢(qián)子堿樣品溶液，按2.2項(xiàng)下方法處理測(cè)定，記錄峰面積.每個(gè)質(zhì)量濃度平行作5份，將測(cè)得樣品的峰面積，代入馬錢(qián)子堿大鼠血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線中，得到樣品的方法回收率.結(jié)果見(jiàn)表3.

表3 血漿中馬錢(qián)子堿的方法回收率(n=5)

2.4 大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究

將大鼠隨機(jī)分為4組，每組6只，雌雄各半，根據(jù)文獻(xiàn)[2-5]及預(yù)試驗(yàn).尾靜脈注射馬錢(qián)子堿納米粒組高、中、低劑量(15、10、5 mg/kg) ，馬錢(qián)子堿溶液低劑量組(5 mg/kg).給藥前12 h禁食，不禁水，給藥方式為尾靜脈注射給藥.于給藥后 5、10、20、40、60、90、120、150、180、210、240、360 min 從眼眶后靜脈叢取血約400 μL，置1.5 mL肝素化離心管中，5 000 r/pm離心10 min，取上清液100 μL，置于-20 ℃中保存待測(cè).取大鼠血漿100 μL，按2.2項(xiàng)下方法處理測(cè)定，進(jìn)樣20 μL進(jìn)行HPLC分析，記錄峰面積，計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)血藥質(zhì)量濃度.

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

血藥質(zhì)量濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)采用3P97進(jìn)行C-T曲線擬合處理，根據(jù)AIC值和擬合優(yōu)度值最小為原則結(jié)合F檢驗(yàn)，所確定的藥物動(dòng)力學(xué)行為均符合二室模型(權(quán)重系數(shù)為1/C/C)，并求得了藥動(dòng)學(xué)參數(shù).藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)分別見(jiàn)表4.

表4 不同給藥組的大鼠藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(n=6)

4 討 論

本實(shí)驗(yàn)建立了大鼠血漿中馬錢(qián)子堿含量測(cè)定的HPLC法，經(jīng)過(guò)方法學(xué)考察，證實(shí)本法簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確，能夠滿足動(dòng)物體內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)研究的需要.實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)馬錢(qián)子堿溶液與馬錢(qián)子堿固體脂質(zhì)納米粒在大鼠體內(nèi)過(guò)程均符合二室模型，藥物動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)結(jié)果表明，在相同給藥劑量時(shí)馬錢(qián)子堿溶液的T1/2α為0.74 min，T1/2β為50.20 min，AUC為417.32 (μg/mL)/min，血漿清除率為0.012 /kg/min.而馬錢(qián)子堿固體脂質(zhì)納米粒的T1/2α和T1/2β分別為0.84 min和136.23 min，AUC值為2 336.03 (μg/mL)/min，血漿清除率為0.002 1 /kg/min.相對(duì)生物利用度為559.8%.馬錢(qián)子堿固體脂質(zhì)納米粒的藥動(dòng)學(xué)特征顯示了馬錢(qián)子堿經(jīng)納米粒包裹后，顯著延長(zhǎng)了藥物在循環(huán)系統(tǒng)中的滯留時(shí)間，生物利用度提高，血藥質(zhì)量濃度平穩(wěn)，降低了清除率，起到一定的緩釋作用，從而可以增強(qiáng)馬錢(qián)子堿的療效.

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