松塔景天組織培養(yǎng)與快速繁殖的研究

胡穎慧 ，馬春祥, 梁孝莉

(1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院牡丹江分院，黑龍江牡丹江157041;2.牡丹江市種子管理處)

松塔景天(SedumnicaeenseAll.)，又名松葉景天，為景天科景天屬多年生常綠肉質(zhì)草本植物，植株基部分蘗能力較強(qiáng)，而成叢狀，株高10～20cm，全株呈灰綠色[1]。葉短針狀，三岀輪生，排列緊密，頂部呈密集的開(kāi)裂松果狀，花黃色。生長(zhǎng)習(xí)性耐旱、極耐寒，喜光，不耐蔭。對(duì)土壤要求不嚴(yán)，但以排水良好、富含腐殖質(zhì)的砂壤土更為適宜?？捎糜谕ピ鹤鞯乇辉灾?，或作花壇鑲邊，或配置模紋花壇，也可盆栽作觀(guān)葉植物置于室內(nèi)，或用于屋頂綠化[2]，在生態(tài)城市建設(shè)中有著極為廣闊的應(yīng)用前景。

松塔景天成活率高、觀(guān)賞性狀優(yōu)良，目前其栽培繁殖已逐步進(jìn)入市場(chǎng)化，繁殖方式以扦插繁殖為主，但此法繁殖率較低，且耗時(shí)耗力。通過(guò)組織培養(yǎng)，在短時(shí)期內(nèi)獲得大量植株，是經(jīng)濟(jì)有效的快速繁殖方法，也是工廠(chǎng)化育苗的主要途徑，此外也可以為合理開(kāi)發(fā)利用和保存野生植物資源提供有價(jià)值的參考，因而對(duì)松塔景天離體快繁的研究在生產(chǎn)上有重大意義。

目前，對(duì)松塔景天的研究主要集中在引種栽培[3]以及抗逆生理響應(yīng)[4-7]等方面，對(duì)組織培養(yǎng)的研究鮮有報(bào)道，僅有邢苗苗等以莖段為外植體，研究了松塔景天和粗壯景天的組培快繁[8]，而本研究是以幼嫩葉片為外植體，通過(guò)器官發(fā)生途徑建立松塔景天的高效快繁體系，相同方法的研究還未見(jiàn)報(bào)道。

1 材料方法

1.1 材料

供試植物材料為松塔景天(SedumnicaeenseAll.)，外植體選擇發(fā)育正常的幼嫩葉片。

1.2 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，蔗糖30g/L、瓊脂7.8g/L、pH值為5.8、培養(yǎng)溫度(25±2)℃、光照強(qiáng)度1500～2000 lx。

1.3 方法

1.3.1 外植體處理。取松塔景天植株幼嫩葉片作為外植體，經(jīng)清水沖洗10min后，用75%的酒精浸泡10～15s表面消毒；再浸入10%次氯酸鈉溶液3～5min；隨后，用滅菌蒸餾水淋洗3次。將其平放在高壓滅菌過(guò)的濾紙上，用滅菌刀將葉片切成0.5cm長(zhǎng)的小塊。

1.3.2 愈傷組織誘導(dǎo)。將外植體接種于含基本培養(yǎng)基附加不同濃度的6-BA(0、0.1、0.5、1.0mg/L)和NAA(0、0.05、0.1、0.15 mg/L)的培養(yǎng)瓶中，每處理接種30個(gè)外植體，重復(fù)3次，置于培養(yǎng)室內(nèi)先進(jìn)行暗培養(yǎng)14d后再進(jìn)行光照培養(yǎng)，觀(guān)察不同激素配比培養(yǎng)基中愈傷組織的生長(zhǎng)狀態(tài)，統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率。

1.3.3 芽分化及再生。將誘導(dǎo)出的松塔景天愈傷組織，切分后分別繼代培養(yǎng)于附加不同濃度6-BA(0.1、0.5、1.0mg/L)和NAA(0.05、0.1、0.15mg/L)的培養(yǎng)瓶中進(jìn)行光照培養(yǎng)，每處理接種30個(gè)愈傷組織，重復(fù)3次，30 d后比較不同濃度植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合下愈傷組織芽分化情況、統(tǒng)計(jì)芽分化率。

1.3.4 生根培養(yǎng)。將誘導(dǎo)的不定芽切下接種于附加不同濃度IBA的生根培養(yǎng)基上。生根培養(yǎng)基以1/2MS為基本培養(yǎng)基，附加4種濃度梯度的IBA(0.1、0.3、0.5、1.0mg/L)，每處理接種50個(gè)不定芽，重復(fù)3次，30d后觀(guān)察生根情況，統(tǒng)計(jì)不定芽生根率。

1.3.5 馴化移栽。待組培苗的根長(zhǎng)達(dá)到3～5cm時(shí)即可進(jìn)行馴化移栽，首先松動(dòng)培養(yǎng)基的瓶蓋1～2d，然后將瓶蓋完全打開(kāi)，倒入少量無(wú)菌水，在培養(yǎng)室中煉苗6～7天后輕輕夾出小苗，洗凈培養(yǎng)基，并避免根部損傷。移栽到混合基質(zhì)(草炭土∶蛭石∶珍珠巖= 2∶1∶1)中，噴霧或澆水加蓋塑料薄膜以保持水分平衡，提高小苗周?chē)諝鉂穸?90%～100%)，減少葉面蒸騰。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理。所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，0.05檢測(cè)水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

將松塔景天外植體接種于不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比培養(yǎng)基中，培養(yǎng)7～10d，切口處開(kāi)始膨大(圖1-A)，經(jīng)過(guò)30d培養(yǎng)，會(huì)有不同程度的愈傷組織長(zhǎng)出，但在不同濃度梯度下，愈傷組織的誘導(dǎo)率明顯不同，愈傷組織的色澤、松散程度及生長(zhǎng)狀態(tài)也有所差別(見(jiàn)表1)。

試驗(yàn)結(jié)果表明，在不添加任何植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及只添加一種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基中，愈傷組織的誘導(dǎo)率顯著低于2種激素不同濃度配比的培養(yǎng)基(表1)，說(shuō)明6-BA及NAA對(duì)松塔景天誘導(dǎo)愈傷組織都起著至關(guān)重要的作用。

由表1可以看出，在MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L培養(yǎng)基上誘導(dǎo)培養(yǎng)的愈傷組織不僅誘導(dǎo)率高達(dá)87.78%，顯著高于其他幾種濃度配比的培養(yǎng)基，且生長(zhǎng)速度快，質(zhì)量最好，外觀(guān)呈淺綠色的顆粒狀(圖1-B)，質(zhì)地較為疏松，生長(zhǎng)速度快。一般認(rèn)為，這種愈傷組織為具有分化能力的愈傷組織[9]。

表1 不同濃度植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)松塔景天愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.2 不同濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比對(duì)愈傷組織芽分化的影響

將長(zhǎng)勢(shì)良好的愈傷組織切割后，接種于不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比培養(yǎng)基中誘導(dǎo)芽分化，培養(yǎng)30d后，統(tǒng)計(jì)芽誘導(dǎo)率見(jiàn)表2，試驗(yàn)結(jié)果表明，在不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度配比中，MS+6-BA 1.0mg/L +NAA0.1mg/L 培養(yǎng)基中愈傷組織芽分化率顯著高于其他培養(yǎng)基，為88.89%，14 d時(shí)愈傷組織表面開(kāi)始出現(xiàn)的綠色芽點(diǎn)(圖1-C)，隨后淡綠色芽點(diǎn)漸漸密集(圖1-D)，30d后迅速誘導(dǎo)產(chǎn)生叢生芽(圖1-E)，將叢生芽切分后進(jìn)行繼代培養(yǎng)，14d后形成不定芽(圖1-F)。

表2 不同濃度植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)松塔景天愈傷組織芽分化的影響

2.3 不同濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)組培苗生根的影響

圖1 松塔景天組培快繁過(guò)程

選擇在最適芽分化培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)的松塔景天組培苗，接種到1/2MS培養(yǎng)基，附加不同濃度的IBA，30d后統(tǒng)計(jì)生根情況(見(jiàn)表3)。

表3 不同濃度IBA對(duì)松塔景天組培苗生根的影響

由表3可以看出，松塔景天組培苗在幾個(gè)不同處理培養(yǎng)基中均能生根，但生根率及根部長(zhǎng)勢(shì)有所不同，在添加0.3 mg/L IBA的培養(yǎng)基中生根率達(dá)91.33%，顯著高于其他濃度處理，且根部長(zhǎng)勢(shì)粗壯，主側(cè)根能夠明顯區(qū)分(圖1-G)，因此1/2MS+0.3 mg/L IBA為松塔景天組培苗最適生根培養(yǎng)基。組培苗生根后獲得完整的再生植株，待根部長(zhǎng)至3～5cm后，進(jìn)行馴化移栽，30 d后松塔景天組培苗成活率達(dá)84%(圖1-H)。

3 討論與結(jié)論

由于植物細(xì)胞在離體狀態(tài)下缺乏合成生長(zhǎng)素和分裂素的能力，因此，在組織培養(yǎng)過(guò)程中往往需要添加適當(dāng)?shù)耐庠粗参锷L(zhǎng)調(diào)節(jié)劑(PGRs)以促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化[10]。PGRs又稱(chēng)植物激素，包括細(xì)胞分裂素、生長(zhǎng)素等。細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素搭配使用可誘導(dǎo)植物脫分化形成愈傷組織，被廣泛應(yīng)用于植物組織培養(yǎng)。但不同的植物對(duì)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類(lèi)和濃度的反應(yīng)不盡相同[11]。

本試驗(yàn)以松塔景天幼嫩葉片為外植體，通過(guò)器官發(fā)生途徑，即誘導(dǎo)愈傷組織、愈傷組織芽分化、生根培養(yǎng)的途徑研究松塔景天的高頻再生體系，試驗(yàn)結(jié)果表明松塔景天最適愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5mg/L+NAA0.05mg/L，愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)87.78%，愈傷組織顏色淡綠色，生長(zhǎng)較快，質(zhì)地疏松。關(guān)于芽分化培養(yǎng)有研究結(jié)果表明，6-BA/NAA的比值高時(shí)有利于不定芽的分化[12-13]，本試驗(yàn)篩選出的最適芽分化培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0mg/L+NAA0.1mg/L，其6-BA/NAA的比值為10，這與前人研究結(jié)果相一致。關(guān)于植物組織生根培養(yǎng)，大多數(shù)試驗(yàn)已得出結(jié)論，以1/2MS作為生根培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基效果較好[14]，因此本試驗(yàn)也使用這種配方，邢苗苗[8]認(rèn)為NAA抑制根的生長(zhǎng)，而IBA適合景天類(lèi)植物生根，并發(fā)現(xiàn)1/2 MS附加IBA 0.5 mg/L為最佳的生根培養(yǎng)基，而本試驗(yàn)篩選出的最適生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA 0.3 mg/L，這可能是由于不同外植體自身的生理結(jié)構(gòu)、分化狀態(tài)以及脫分化能力存在的差異造成的。長(zhǎng)勢(shì)良好的組培苗經(jīng)馴化移栽后成活率達(dá)84%。

本試驗(yàn)建立了松塔景天快速繁殖體系，可大量提供優(yōu)質(zhì)松塔景天組培苗，此外還可為松塔景天的種植資源保存、品種改良等提供一定的指導(dǎo)意義。

[1]孔秋真,趙曉東,聶世煥.地被植物在城市園林綠化中的應(yīng)用[J].河南科技,2010(2):73.

[2]矯國(guó)榮,張國(guó)梁,吳秀峰,等.八寶景天等四種景天屬植物的引種馴化與繁育[J].園林科技,2006(3):5-14.

[3]楊建華,童俊,陳法志,等.幾種景天屬植物引種及其扦插繁殖研究[J].湖北林業(yè)科技,2009(2):31-33.

[4]孫國(guó)峰,張金政,石雷,等.滲透脅迫對(duì)CAM植物——松塔景天幼苗保護(hù)酶及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響[A].2008北京奧運(yùn)園林綠化的理論與實(shí)踐論文集,2009.

[5]孟慶芳,沈漫,劉婷,等.3種景天植物低溫適應(yīng)性的研究[J].北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào),2011(2):50-53.

[6]路潔,彭勵(lì),倪細(xì)爐,等.景天屬5種景觀(guān)地被植物抗旱能力的綜合評(píng)價(jià)[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2011,27(4):108-114.

[7]高小燕.幾種景天科植物抗旱性及其生理機(jī)制的研究[D].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),2009.

[8]邢苗苗,沈漫,高遐虹,等.2種景天植物組培快繁的研究[J].北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào),2010,25(1):65-68.

[9]安利佳,姜長(zhǎng)陽(yáng).植物組織培養(yǎng)導(dǎo)論[M].大連:遼寧師范大學(xué)出版社,1997:55-60.

[10]崔凱榮,刑更生,周攻克,等.植物激素對(duì)體細(xì)胞胚胎發(fā)生的誘導(dǎo)與調(diào)節(jié)[J].遺傳,2000,22(5): 349-354.

[11]黃勇,張鐵,張文生,等.三七組織培養(yǎng)研究綜述[J].文山學(xué)院學(xué)報(bào), 2012,25(6): 13-15.

[12]黃遠(yuǎn)新,何鳳發(fā),張盛林.魔芋組織培養(yǎng)與快繁技術(shù)研究[J].西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2003,25(4):309-312.

[13]樊國(guó)盛,鄧?yán)蛱m.西南樺組織培養(yǎng)研究[J].西南林學(xué)院學(xué)報(bào),2000,20 (3) :147-151.

[14]譚文澄.觀(guān)賞植物組織培養(yǎng)技術(shù)[M].北京:中國(guó)林業(yè)出版社,1991.