鼻咽癌干細胞標志物的檢測意義

江慶萍 謝思明 王 爽 儲 兵 姚開泰

腫瘤干細胞在腫瘤發(fā)生發(fā)展和治療中都起著至關重要的作用，所以在腫瘤研究中是不可回避的關鍵問題。2007年，Wang等[4]用免疫熒光法檢測CK8、CK18和CK19在SP細胞和NSP細胞中的表達，發(fā)現(xiàn)CK8和CK18在兩種細胞中均強表達，而CK19只在SP細胞中有14.5%的表達，非SP細胞中未見表達，據(jù)此作者認為CK19是鼻咽癌干細胞一個潛在的重要分子標志，并被各類文獻引用。而CD133被作為多種腫瘤的干細胞標志物為大家所熟知。本文將通過檢測CK19、CD133在正常鼻咽黏膜、鼻咽癌組織、永生化和鼻咽癌細胞株中的表達，進一步確定鼻咽癌干細胞表面標志物。

1 材料與方法

1.1 材料

選取廣東省中山市人民醫(yī)院病理科附有正常黏膜和非典型增生的鼻咽癌組織標本39例，其中男性19例，女性20例，年齡23～73歲，并另選取11例正常鼻咽黏膜上皮組織作為對照。細胞株：5-8F、6-10B，低分化鼻咽癌細胞系，由中山大學附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所建立，生長培基為PRMI1640+10%FCS，細胞呈上皮樣、貼壁生長，具有高成瘤和高轉移能力。CNE2:低分化鼻咽癌細胞系，南方醫(yī)科大學腫瘤研究所建立，生長培基為PRMI1640+10%FCS，細胞呈上皮樣、貼壁生長。NP69:鼻咽永生化細胞系，由中山大學附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所建立，生長培基為Keratinocyte-SFM(GIBCO)，細胞呈上皮樣、貼壁生長?？贵w：CD133/1(AC133)單克隆抗體購自德國Miltenyi公司，CK19(GM088801)、CK14(LL002)為中國福州邁新公司產(chǎn)品，CK8(35βH11)、CK18(DC10) 購于美國KAKO公司。免疫組化SP試劑盒、DAB染色試劑盒均為中國福州邁新生物技術公司產(chǎn)品。裸鼠：BALB/c-nude裸鼠，4～6周齡，雌性，購自南方醫(yī)科大學動物實驗中心，等級為無特定病原體動物(specific pathogen-free animals，SPF)。

1.2 方法

1.2.1 裸鼠體內成瘤 5-8F、6-10B和CNE2細胞處于對數(shù)生長期時，以1×106個細胞分別注入2只裸鼠雙側腋下，觀察成瘤情況。8周后，取出瘤塊，固定、石蠟包埋并切片。

1.2.2 免疫組化SP 按試劑說明書進行，微波修復10 min，CD133抗體稀釋濃度為1∶50；DAB顯色；中性樹膠封片。

1.2.3 免疫細胞化學法 潔凈玻片高壓消毒，滴上細胞，培養(yǎng)24 h細胞完全爬片后終止培養(yǎng)，免疫細胞化學為SP法，按試劑說明書進行，CD133抗體稀釋濃度為1∶50；DAB顯色；中性樹膠封片。

1.2.4 免疫組化結果判斷方法 按細胞著色評分：棕褐色 3分；棕黃色 2分；淡黃色 1分；無著色 0分。按陽性細胞數(shù)評分：一個視野內陽性細胞數(shù)>75% 為4分；51%～75%為3分；11%～50%為2分；1%～10% 為1分；無陽性細胞為0分。上述兩項得分相乘為最后結果，3分為“+”；4分為“++”； 5分以上為“+++”?！?～+++”為陽性表達。

1.2.5 PCR檢測3種癌細胞株中CD133基因 提取5-8F、6-10B和CNE2的RNA，對經(jīng)檢測完好的RNA進

行逆轉錄反應，按照PrimeScriptTM 逆轉錄試劑盒說明書進行cDNA的合成，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR反應。反應體系：10×buffer 1μl，Taq酶0.15 μl；dNTP 0.8 μl；上游引物0.2 μl，下游引物0.2 μl，cDNA 0.5 μl，H2O 7.15 μl，總體積 10 μl。反應條件：93 ℃預變性2 s；然后為93 ℃ 10 s、51 ℃ 10 s、72 ℃ 5 s，30個循環(huán)，最后72 ℃ 5 min。取5 μl 產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠上電泳以檢測CD133基因是否存在。

2 結果

2.1 CK19在鼻咽癌和黏膜慢性炎組中的表達

結果發(fā)現(xiàn)CK19在大部分鼻咽癌組織中呈強陽性表達(37/39，67.2%)。黏膜慢性炎柱狀上皮中呈強陽性表達，化生鱗狀上皮中呈陽性表達。

2.2 CK19在鼻咽癌細胞株及其裸鼠移植瘤中的表達

檢測了CK19在5-8F、6-10B和CNE2裸鼠移植瘤中的表達情況，結果發(fā)現(xiàn)CK19在3種移植瘤中都有散在點巢狀陽性。CK19在5-8F、6-10B和CNE2 3個細胞株中均呈陰性表達。

2.3 免疫組化檢測鼻咽癌組織中CD133表達

39例鼻咽癌組織中8例僅有個別癌巢的邊緣見散在CD133+細胞，2例黏膜上皮主要是基底部細胞CD133呈陽性。11例鼻咽黏膜組織中未見CD133陽性細胞。

2.4 免疫細胞化學檢測永生化細胞株NP69和癌細胞株中CD133表達情況

鼻咽永生化細胞株NP69中見散在的CD133+細胞，在10個高倍視野下陽性細胞率平均為1.5%。但3種癌細胞株5-8F、6-10B和CNE2細胞爬片連續(xù)6次免疫細胞化學檢測均未發(fā)現(xiàn)陽性細胞，考慮原因可能是在這些細胞株中CD133+細胞含量很低或者CD133表達很弱，導致在細胞爬片這種有限的細胞數(shù)量中難以檢出，故進一步采用PCR法驗證這3種癌細胞株中是否有CD133基因表達。

2.5 PCR檢測3種鼻咽癌細胞株中CD133的存在

5-8F、6-10B和CNE2細胞分別提取RNA，逆轉錄為cDNA，進行CD133基因PCR反應，以GAPDH為內參，重復兩次。1%凝膠電泳結果兩次完全一致，結果顯示100～200 bp間CD133基因在3個細胞株均有清晰的條帶(圖1)。

1為5-8F-GAPDH;2為5-8F-CD33;3為 6-10B-GAPDH;4為6-10B-CD133;5為CNE2-GAPDH;6為CNE2-CD133。

圖1 凝膠電泳檢測CNE2、6-10B和5-8F鼻咽
癌細胞株中CD133表達

3 討論

3.1 CK19的表達特征及能否作為NPC干細胞標志物的分析

上皮組織因為有上皮特有的角蛋白表達，人們通常在研究上皮組織正常和腫瘤干細胞標志物時常試圖尋找是否有角蛋白標志物。1996年，Michel等[1]證實了CK19為皮膚干細胞標記物。2001年，Collins[2]發(fā)現(xiàn)前列腺干細胞表達α2β1和CK5及CK14。2006年，Ricci-Vitiani等[3]證明結腸癌干細胞CD133+CK20-。2007年，Wang等[4]用免疫熒光法檢測CK8、CK18和CK19在SP細胞和NSP細胞中的表達，發(fā)現(xiàn)CK8和CK18在2種細胞中均強表達，而CK19只在SP細胞中有14.5%的表達，認為CK19是鼻咽癌干細胞一個潛在的重要分子標志。但我們的試驗結果讓我們對CK19是否為鼻咽癌干細胞標志物提出了疑問。在對鼻咽癌組織、細胞株裸鼠皮下移植瘤和細胞株進行CK19檢測時發(fā)現(xiàn)，雖然CK19在3個細胞株5-8F、6-10B和CNE2中幾乎沒有見到陽性細胞表達，但3個細胞株移植瘤中CK19呈灶性或散在表達，鼻咽癌標本中67.2%的癌組織更呈彌漫強陽性表達，黏膜慢性炎和鼻咽癌癌旁腺上皮均陽性，部分化生鱗狀上皮也陽性。根據(jù)干細胞概念，它們是一群稀少的保持數(shù)量恒定和具有自我更新能力的細胞，而在鼻咽癌和鼻咽黏膜慢性炎中CK19如此廣泛地表達，我們認為把它作為干細胞標志物是不恰當?shù)?。它在細胞株、裸鼠移植瘤和鼻咽癌以及黏膜慢性炎組織中的表達水平不同可能與細胞所處微環(huán)境有關，而非因為是干細胞標志物。

3.2 CD133分布特性及作為鼻咽干細胞標志物可能性研究

Prominin-1(別名CD133，AC133) 分子是1個有5個跨膜域的獨特糖蛋白,它最早于1997年在小鼠神經(jīng)上皮干細胞中發(fā)現(xiàn)，并因為它在細胞膜上明顯的突出定位被命名為Prominin-1[5]。在多細胞生物中Prominin-1普遍表達，分布廣泛。在小鼠Prominin-1發(fā)現(xiàn)的同年，Yin等[6]從胎兒肝臟，骨髓和臍帶血中分離出的CD34+造血干細胞發(fā)現(xiàn)了Prominin-1人類同系物AC133(CD133)。后來，人們在造血系統(tǒng)外的不同器官和組織中都相繼發(fā)現(xiàn)CD133+細胞具有干細胞功能。VEGF-R2+的內皮組細胞上CD133陽性表達，隨著這些細胞的成熟，CD133表達迅速減弱[7]。

不僅在正常間葉和上皮組織中人們發(fā)現(xiàn)CD133+細胞具有干細胞的功能，在腫瘤組織中人們也發(fā)現(xiàn)多種腫瘤干細胞即“腫瘤干細胞”表達CD133。如神經(jīng)膠質瘤、結腸癌、前列腺癌等[8-10]。那么，CD133是否也是鼻咽組織和癌細胞的干細胞標志呢？目前相關文獻研究很少。

本實驗首先利用免疫組織化學和免疫細胞化學觀察鼻咽黏膜慢性炎標本和附有不典型增生的鼻咽癌組織CD133以及黏膜正常上皮細胞、永生化細胞和癌細胞株中的表達情況，從而了解CD133是否有成為鼻咽干細胞標志物的可能。結果發(fā)現(xiàn)，在39例鼻咽癌中有8例在散在癌巢邊緣區(qū)域見有散在CD133陽性細胞分布，2例鼻咽上皮基底部陽性，11例黏膜慢性炎均陰性。從結果分析，雖然39例癌組織只有8例有陽性，但因為鼻咽部局限，并且取材標本只有數(shù)毫米大小，只占癌組織的極個別部位，所以不能認為其他31例沒有CD133陽性細胞。從以往關于其他腫瘤和正常組織中干細胞分布位置和數(shù)量的研究[11-12]以及本作者LRCs的探討中發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞常分布于癌巢邊緣和上皮基底部，并且數(shù)量稀少，我們的免疫組化結果同此特征相符合，從而從組織學角度證明CD133可以假設為鼻咽干細胞標志物進行以后的分離和特性鑒定試驗。

永生化細胞株NP69及鼻咽癌細胞株免疫細胞化學檢測發(fā)現(xiàn)，NP69有散在的CD133+細胞存在,其中后者十個高倍視野下有1.5%，而鼻咽癌細胞株5-8F、6-10B和CNE2重復數(shù)次均未檢測到CD133表達。我們把3種癌細胞行qRT-PCR反應，結果顯示5-8F、CNE2和6-10B均見明顯清晰的條帶。綜上所述，我們認為CD133可能是鼻咽正常和腫瘤干細胞標志物。2013年，也有學者證實CD133為鼻咽癌干細胞標記物[13]。

根據(jù)CK19在鼻咽癌和黏膜慢性炎標本、鼻咽癌細胞株移植瘤和細胞株中的表達情況，提出CK19并非為鼻咽癌干細胞標志物，它表達的不同可能與癌細胞所處微環(huán)境不同有關。從組織和細胞學水平上觀察，我們認為CD133是鼻咽癌可能干細胞標志物，為后續(xù)研究打下基礎。

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