基于雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)建立miR-140生物傳感器

高原，鄒陽，于影，林金德，張春麗，溫傳俊，沈干

(1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬友誼整形外科醫(yī)院 科教辦，江蘇 南京 210029； 2.南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 分子細(xì)胞生物學(xué)研究所，江蘇 南京 210023； 3.南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 整形外科，江蘇 南京 210003)

成熟的microRNAs(miRNAs)是一類高度保守的內(nèi)源性非編碼小分子RNA(約22 nt)，通過完全或部分互補(bǔ)結(jié)合靶mRNAs的3′端非翻譯區(qū)(3′UTR)負(fù)調(diào)控靶基因表達(dá)[1-2]。

miRNAs具有組織特異性及發(fā)育時序性[3]，與靶基因之間是多對多的關(guān)系，形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。miRNAs的異常表達(dá)常常與疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系，例如腫瘤[4]、關(guān)節(jié)炎[1]和心血管疾病[5]等，因此關(guān)于miRNAs的檢測技術(shù)和方法對研究其作用機(jī)制以及相關(guān)疾病的診斷治療具有重要意義。迄今為止，檢測miRNA表達(dá)水平的方法已得到迅速發(fā)展，主要包括Northern blot[6-7]、微陣列芯片[8]、實(shí)時熒光定量PCR[9]等方法，總體上可將其歸為探針雜交技術(shù)和樣本擴(kuò)增技術(shù)[10]。然而相比這些方法不能檢測miRNA活性的缺點(diǎn)，熒光素酶報告基因表達(dá)系統(tǒng)是一種能夠檢測miRNA活性的生物傳感器。本研究旨在利用雙熒光素酶報告基因構(gòu)建miR-140生物傳感器，并進(jìn)行初步應(yīng)用研究。

1 材料與方法

1.1 主要材料

SD大鼠由南京青龍山實(shí)驗(yàn)動物中心提供；psiCHECK-2載體為本課題組實(shí)驗(yàn)室保存；引物由上海生工生物工程公司合成；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時定量PCR試劑盒、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶XhoⅠ、NotⅠ購自TaKaRa公司；microRNA由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成(miR-140 mimics為內(nèi)源性成熟miR-140的模擬物)；胎牛血清、α-MEM購自Gibco公司；DMEM購自Wisent公司；轉(zhuǎn)染試劑GenEscortTMI購自Wisegen公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自Promega公司。

1.2 miR-140 sensor的構(gòu)建

本實(shí)驗(yàn)采用含雙熒光素酶報告基因的psiCHECK-2為載體。針對miR-140成熟體序列設(shè)計含4個拷貝反義序列的寡聚核苷酸(表1)，畫線部分分別為4個拷貝的反義序列和miR-140成熟體序列，于95 ℃ 3 min自然冷卻至室溫，磷酸化后與XhoⅠ、NotⅠ雙酶切的psiCHECK-2載體連接，16 ℃過夜。取5 μl轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)。挑取克隆提質(zhì)粒，測序鑒定。

表1miR-140的靶序列

Tab1miR-140targetsequence

序列名稱寡聚核苷酸序列正義鏈5'-TCGAGCTACCATAGGGTAAAACCACTGCTACCATAGGGTAAAACCACTGCTACCATAGGGTAAAACCACTGCTACCATAGGGTAAAACCACTGC-3'反義鏈5'-GGCCGCAGTGGTTTTACCCTATGGTAGCAGTGGTTTTACCCTATGGTAGCAGTGGTTTTACCCTATGGTAGCAGTGGTTTTACCCTATGGTAGC-3'

1.3 rat MSCs的分離、純化培養(yǎng)

選取健康4周齡的SD雄性大鼠，清潔級，體質(zhì)量在80～100 g，將其脫臼處死后置于體積分?jǐn)?shù)75%酒精浸泡約5 min并在無菌條件下分離出大鼠的股骨和脛骨。用注射器吸取10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基將骨髓沖出，制成單細(xì)胞懸液，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)。48 h更換培養(yǎng)基，每3 d換液1次。

1.4 rat MSCs成軟骨誘導(dǎo)

將rat MSCs接種于6孔板，24 h后更換成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，同時設(shè)對照組，培養(yǎng)7 d后提取RNA。誘導(dǎo)培養(yǎng)基：DMEM高糖培養(yǎng)液(含L-谷氨酰胺和丙酮酸鈉),1% FBS,1%抗生素,10 ng·ml-1TGF-β1,1% ITS,40 μg·ml-1脯氨酸,100 nmol·L-1地塞米松，50 μg·ml-1維生素C。對照培養(yǎng)基：DMEM高糖培養(yǎng)液(含L-谷氨酰胺和丙酮酸鈉),1% FBS,1%抗生素。

1.5 RNA的提取與實(shí)時熒光定量PCR(RT-qPCR)

參照Trizol reagent說明書(Invitrogen)提取RNA；采用50 ℃特異性反轉(zhuǎn)錄miR-140；RT-qPCR以RNU6-1為內(nèi)參，采用SYBR Green I嵌合熒光法，退火溫度為65 ℃，用2-ΔΔCt定量法分析數(shù)據(jù)結(jié)果。引物序列見表2。

表2RT-qPCR的引物序列

Tab2RT-qPCRprimersequences

RNA引物名稱序列miR-140RT75'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCTACCAT-3'F185'-ACACTCCAGCTGGGCAGTGGTTTTACCCTATG-3'通用反向5'-TGGTGTCGTGGAGTCG-3'RNU6-1正向5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'反向5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'

1.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及熒光素酶活性分析

轉(zhuǎn)染前24 h，將細(xì)胞接種于24孔板，miR-140 sensor(0.5 μg)和miR-140 mimics(20 nmol·L-1、50 nmol·L-1)共轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，設(shè)對照組，轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行熒光素酶活性檢測；miR-140 sensor(0.5 μg)轉(zhuǎn)染rat MSCs，24 h后更換成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d，設(shè)對照組，每組3個復(fù)孔，進(jìn)行熒光素酶活性檢測。熒光素酶活性檢測采用雙熒光素酶報告基因試劑盒和熒光化學(xué)發(fā)光微孔板檢測儀，所得數(shù)值為海腎與螢火蟲熒光素酶活性的比值。

2 結(jié) 果

2.1 miR-140 sensor的設(shè)計與構(gòu)建

根據(jù)miRBase數(shù)據(jù)庫(http://www.mirbase.org/)獲得的miR-140成熟序列設(shè)計4個拷貝反義序列，將其插入psiCHECK-2上的多克隆位點(diǎn)，經(jīng)轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)，可轉(zhuǎn)錄出融合基因的mRNA，能夠結(jié)合細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的miR-140，同時熒光信號降低，螢火蟲熒光素酶的酶活作為內(nèi)參(圖1)。

T7：T7 RNA聚合酶啟動子；Rluc：海腎熒光素酶基因；miR-140T：miR-140靶結(jié)合位點(diǎn)；poly(A)：多聚腺苷酸；HSV-TK：HSV-TK啟動子；Fluc：螢火蟲熒光素酶基因

圖1miR-140sensor的結(jié)構(gòu)示意圖

T7:T7 RNA polymerase promoter;Rluc:Renilla luciferase gene;miR-140T:miR-140 target sequence;poly(A):polyadenylic acid;HSV-TK:HSV-TK promoter;Fluc:Firefly luciferase gene

Fig1SchematicmapofmiR-140sensor

2.2 miR-140 sensor的功能驗(yàn)證

將miR-140 sensor與20 nmol·L-1、50 nmol·L-1的miR-140 mimics共轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，結(jié)果顯示，miR-140 mimics能降低49%(P=0.001 4)、65%(P=0.001 9)的熒光活性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，表明miR-140 sensor可通過結(jié)合miR-140抑制海腎熒光素酶的熒光活性反映miR-140活性(圖2)。

P：psiCHECK-2；miR-140：miR-140 mimics；NC：短片段雙鏈RNA陰性對照；Sensor：miR-140 sensor

圖2miR-140sensor的功能分析

P:psiCHECK-2;miR-140:miR-140 mimics;NC:Negative Control;Sensor:miR-140 sensor

Fig2FunctionalanalysisofmiR-140sensor

2.3 miR-140 sensor在成軟骨誘導(dǎo)分化中測定miR-140活性

miR-140已被證實(shí)在成軟骨誘導(dǎo)分化中表達(dá)水平上升，因而將rat MSCs成軟骨誘導(dǎo)7 d后，根據(jù)RT-qPCR法檢測結(jié)果顯示(圖3a)，誘導(dǎo)組的miR-140表達(dá)水平顯著上調(diào)(P=0.000 7)，與文獻(xiàn)報道一致。為進(jìn)一步驗(yàn)證miR-140 sensor的功能，將其轉(zhuǎn)染rat MSCs，24 h后成軟骨誘導(dǎo)7 d(圖3b)，誘導(dǎo)組miR-140 sensor的熒光素酶活性降低43%(P=0.014 1)，提示miR-140活性升高。

(a) RT-qPCR法檢測rat MSCs成軟骨誘導(dǎo)中miR-140的表達(dá)水平；(b) Luciferase分析rat MSCs成軟骨誘導(dǎo)中miR-140 sensor的熒光素酶活性

圖3miR-140sensor在成軟骨誘導(dǎo)中的應(yīng)用

(a) Relative miR-140 expression level by RT-qPCR analysis in chondrogenesis of rat MSCs;(b) Relative luciferase activity of miR-140 sensor by luciferase analysis in chondrogenesis of rat MSCs

Fig3ApplicationofmiR-140sensorinchondrogenesis

3 討 論

miRNAs通過轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，在細(xì)胞生長、分化、凋亡等生理病理過程中發(fā)揮重要作用[11-13]。其中，miR-140被認(rèn)為參與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過程并作為潛在的治療靶點(diǎn)而受到廣泛關(guān)注。骨關(guān)節(jié)炎是較為常見的慢性關(guān)節(jié)疾病，與年齡密切相關(guān)[14]。miR-140對軟骨的發(fā)育和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)起著重要的調(diào)節(jié)作用，若其功能缺失則可產(chǎn)生類似骨關(guān)節(jié)炎的現(xiàn)象。其在人類軟骨形成中表達(dá)增加并且豐富存在于軟骨組織，然而在關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)軟骨中，miR-140的表達(dá)水平顯著降低[15-16]。

RT-qPCR法作為常用的miRNAs檢測方法具有高靈敏度、特異性好，但是操作繁瑣、費(fèi)時費(fèi)力、模板質(zhì)量要求高且只能檢測miRNAs的表達(dá)水平，不能反映miRNAs在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)的活性。然而將miRNAs的反義重復(fù)序列插入熒光素酶報告基因的3′UTR構(gòu)建成miRNAs傳感器，可通過報告基因的熒光活性來反映miRNAs的活性。普洛麥格公司研發(fā)了一種將螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶組合的雙報告基因載體psiCHECK-2，海腎熒光素酶的3′UTR含有多克隆位點(diǎn)可插入靶基因序列，螢火蟲熒光素酶作為內(nèi)對照使測量結(jié)果正態(tài)化，檢測方法簡便、快速、靈敏。

本研究將miR-140的反義重復(fù)序列插入psiCHECK-2載體構(gòu)建miR-140 sensor，并進(jìn)行驗(yàn)證以及應(yīng)用于在rat MSCs成軟骨誘導(dǎo)中反映miR-140的活性變化，結(jié)果與RT-qPCR法檢測的miR-140表達(dá)水平相一致，證明miR-140 sensor是一種可進(jìn)行miR-140活性分析的生物傳感器。

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