關(guān)于腰椎間盤退變過程中基質(zhì)金屬蛋白酶-13的來源

胡寶山 許喜筠 郭元利 芮 鋼

(廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，福建 廈門 361003)

椎間盤退變的病因和發(fā)病機(jī)制是近年來的研究熱點(diǎn)，目前發(fā)現(xiàn)退變椎間盤中，均有細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)等物質(zhì)存在，但細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)在椎間盤內(nèi)的來源未見相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察椎間盤細(xì)胞受到誘導(dǎo)刺激能否自分泌產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-13，進(jìn)一步揭示退變椎間盤中MMPs的來源。

1 材料與方法

1.1材料 新西蘭大白兔40只，平均體質(zhì)量2.6 kg，雌雄不限，由廈門大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供。主要試劑：120 kD纖維黏連蛋白(Fn，美國Chemicon公司)，TRIzol 試劑(美國MRC公司)，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(美國Promega公司)，5×M-MLV 緩沖液、RNA酶抑制劑、100 bp DNA Marker、5 mmol/L dNTP Mixture、TaqTMDNA聚合酶(TaKaRa中國大連公司)。主要儀器：OLYMPUS CX-40顯微鏡(日本Olympus光學(xué)工業(yè)株式公司)，Gyroscan intera T 1.5磁共振儀(德國Philip公司)，高速離心機(jī)(德國Philip公司)。

1.2椎間盤細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 新西蘭大白兔，空氣栓塞處死。無菌取椎間盤，刮除髓核并削除纖維環(huán)，顯露軟骨終板并用小刀片及剪刀小心削剪軟骨終板，將軟骨終板和纖維環(huán)組織分別放入盛有無血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，離心得到軟骨終板細(xì)胞和纖維環(huán)細(xì)胞，加入10 ml DMEM/F12培養(yǎng)基吹打均勻后轉(zhuǎn)移到75 cm2培養(yǎng)瓶中在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。原代軟骨終板細(xì)胞大概10 d左右融合，原代纖維環(huán)細(xì)胞大約8 d融合，之后每3天換液1次，按時(shí)用倒置顯微鏡觀察、拍照。細(xì)胞增殖融合為單層幾乎覆蓋瓶底時(shí)用0.25%胰蛋白酶消化并進(jìn)行細(xì)胞傳代。兩種細(xì)胞一般均為8 d左右傳代。因椎間盤髓核細(xì)胞經(jīng)多次培養(yǎng)只能原代成活，無法進(jìn)行傳代，未進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。

1.3施加120 kD Fn-f處理因素 將軟骨終板細(xì)胞接種到放有6孔培養(yǎng)板內(nèi)，以5×105/ml密度接種，每孔加入含10%的胎牛血清 DMEM-F12培養(yǎng)基1.5 ml，在5% CO2、37℃的孵育箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁80%融合后，吸出培養(yǎng)基，加入無血清DMEM-F12培養(yǎng)基后分成兩組：第1組加Fn終濃度為1 μmol/L作試驗(yàn)組，第2組加入等量PBS作為對照，在6孔板內(nèi)培養(yǎng)36 h，用于提取總RNA半定量分析MMP-13的表達(dá)，同時(shí)對兩組細(xì)胞行MMP-13的免疫熒光檢測。纖維環(huán)細(xì)胞處理方法同上。

1.4RT-PCR檢測mRNA的表達(dá) 分別收集實(shí)驗(yàn)組和對照組6孔板內(nèi)細(xì)胞，將細(xì)胞進(jìn)行裂解后按前述方法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后得到cDNA。獲得cDNA后按下面引物和反應(yīng)條件進(jìn)行PCR反應(yīng)，電泳后觀察相應(yīng)條帶的表達(dá)情況，操作方法同前。MMP-13引物：上游 5’-TCTGGAAGCAGGACCAGA-3’；下游：5’-CATAAATATGCTGAGGTC-3’。

1.5MMP-13的免疫熒光顯色 取兩組第2代細(xì)胞爬片，用冷PBS液沖洗3次，3 min/次。新鮮配制的4%多聚甲醛固定30 min，3% H2O2甲醇溶液室溫浸泡10 min，以滅火內(nèi)源性過氧化物酶。用0.01 mol/L PBS洗3次，3 min/次。0.5%Triton×100(PBS配制)，孵育2次，10 min/次，PBS液沖洗3次，3 min/次。滴加正常山羊血清封閉液，室溫封閉20 min，以消除非特異性著色。甩去多余的封閉液，不沖洗。試驗(yàn)組滴加1∶20稀釋的MMP-13單克隆抗體，對照組滴加等量PBS，濕盒內(nèi)4℃孵育過夜，37℃復(fù)溫45 min，0.01 mol/L PBS液洗3次，3 min/次。滴加1∶64稀釋的FITC二抗，37℃孵育30 min～1 h，綠色熒光鏡下觀測顯色，拍攝圖片。

2 結(jié) 果

2.1細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察 椎間盤細(xì)胞經(jīng)過計(jì)數(shù)，以5×105個(gè)/ml密度接種，細(xì)胞活力95%左右。接種的細(xì)胞為圓形，核明亮而清楚，懸浮于培養(yǎng)基中。細(xì)胞大小略有差異。24 h后細(xì)胞開始貼壁，圓形增大，伸展形成突起，變得扁平透亮；48 h后貼壁細(xì)胞逐漸增多；第5天，大部分細(xì)胞已經(jīng)貼壁，軟骨細(xì)胞呈小三角形、多角形或短梭形。纖維環(huán)細(xì)胞于第3天大部分完成貼壁，呈梭型，并呈現(xiàn)旋渦樣同向生長趨勢(圖2)。髓核細(xì)胞集落樣生長，高倍鏡下如涂布樣，見圖1。由于細(xì)胞數(shù)量很少，無法完成傳代。8～10 d左右，原代細(xì)胞基本融合，形成單層，連接成片。傳代后的細(xì)胞一般36 h內(nèi)即可完全貼壁，7 d左右細(xì)胞形成單層融合。隨著傳代的次數(shù)增加，軟骨終板細(xì)胞逐漸增大，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)空泡，胞質(zhì)/核比例增大，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則。傳至第5代，細(xì)胞生長變慢。

2.2120 kD Fn-f對MMP-13 mRNA表達(dá)的影響 軟骨終板兩組內(nèi)參GAPDH均在理論條帶位置出現(xiàn)相應(yīng)條帶，有所表達(dá)。試驗(yàn)組出現(xiàn)100～200 bp條帶，符合MMP-13 mRNA表達(dá)的理論值，說明在120 kD Fn-f的作用下終板軟骨細(xì)胞能夠表達(dá)MMP-13 mRNA。對照組沒有相應(yīng)條帶產(chǎn)生，說明終板軟骨細(xì)胞自身無刺激條件下不會(huì)表達(dá)MMP-13。纖維環(huán)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組同樣得到MMP-13 mRNA的表達(dá)條帶，但是和軟骨終板細(xì)胞相比，表達(dá)量很少，而PBS對照組沒有相應(yīng)條帶的表達(dá)(圖2)。

終板軟骨細(xì)胞

纖維環(huán)細(xì)胞

原代髓核細(xì)胞

EP：終板軟骨細(xì)胞；AF：纖維環(huán)細(xì)胞

2.3熒光免疫顯色 試驗(yàn)組軟骨終板細(xì)胞產(chǎn)生綠色熒光，說明在120 kD Fn-f誘導(dǎo)下軟骨終板細(xì)胞能產(chǎn)生MMP-13，纖維環(huán)組熒光表達(dá)量非常少，甚至不表達(dá)。對照組軟骨終板細(xì)胞和纖維環(huán)細(xì)胞沒有綠色熒光產(chǎn)生，沒有MMP-13的表達(dá)(圖3)。

終板軟骨細(xì)胞

纖維環(huán)細(xì)胞

3 討 論

終板軟骨細(xì)胞由于軟骨終板細(xì)胞為透明軟骨，故其細(xì)胞外基質(zhì)主要由Ⅱ型膠原和蛋白多糖組成，通過番紅-0對基質(zhì)中的蛋白多糖和甲苯胺蘭對糖胺多糖特異性染色，以及對Ⅱ型膠原進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，再結(jié)合取材的部位，即可鑒定是否是軟骨終板細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)通過上述染色證實(shí)，所培養(yǎng)的細(xì)胞具有軟骨細(xì)胞的表型特征，即可以合成分泌蛋白多糖和Ⅱ型膠原，因此，可以證明所培養(yǎng)的細(xì)胞為軟骨終板細(xì)胞。

纖維環(huán)細(xì)胞目前為止還沒有特異的鑒定方法，一般來說根據(jù)取材的部位和細(xì)胞形態(tài)的描述。由于椎間盤組織為三明治結(jié)構(gòu)，和其他組織分界清楚，而且終板軟骨和纖維環(huán)雖然連接緊密，但是細(xì)胞形態(tài)截然不同，因此根據(jù)這兩點(diǎn)可以進(jìn)行纖維環(huán)細(xì)胞的鑒定。一般來說當(dāng)細(xì)胞貼壁融合后，細(xì)胞形態(tài)成梭形，而且細(xì)胞呈現(xiàn)一種同向性生長趨勢，也就是細(xì)胞長軸方向相同，為旋渦樣或水流樣生長。本實(shí)驗(yàn)所得細(xì)胞和上述描述基本相同。因此認(rèn)為是纖維環(huán)細(xì)胞。其細(xì)胞類型應(yīng)該屬于成纖維細(xì)胞。兔細(xì)胞傳代過4代后，細(xì)胞形態(tài)會(huì)發(fā)生變化，多數(shù)細(xì)胞會(huì)變圓，同時(shí)細(xì)胞同向性生長趨勢消失。

髓核細(xì)胞由于數(shù)量稀少，細(xì)胞活力低下，本實(shí)驗(yàn)只成功培養(yǎng)了兔椎間盤的原代髓核細(xì)胞。沒能成功進(jìn)行傳代，可能其方法學(xué)還須進(jìn)一步改進(jìn)。其鑒定目前為止亦沒有標(biāo)準(zhǔn)方法，同樣需通過取材位置和細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行。細(xì)胞形態(tài)和軟骨終板細(xì)胞較為相似，亦呈現(xiàn)多角形，但是不同之處在于細(xì)胞偽足長、較多，胞質(zhì)向外突起，呈“涂布樣”。可能由于原代的關(guān)系，細(xì)胞呈集落樣聚集，一般不能長滿瓶壁。

椎間盤退變主要表現(xiàn)在終板、髓核、纖維環(huán)中細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的變化，其中基質(zhì)成分的病理改變在椎間盤退變的發(fā)生發(fā)展過程中起著及其重要的作用，退變間盤基質(zhì)的變化主要表現(xiàn)在蛋白多糖的降解，非聚合性蛋白多糖成分增多，降解產(chǎn)物聚積；Ⅱ型膠原降解，濃度降低，Ⅰ型Ⅱ型膠原比例失調(diào)，研究表明在此過程中許多與基質(zhì)成分改變相關(guān)的蛋白酶類均參與了這一病理過程，其中以MMPs尤為重要。

MMPs主要有兩方面的功能，①幾乎能夠降解多糖以外的所有細(xì)胞外基質(zhì)成分。②激活其他酶類產(chǎn)生連鎖放大效應(yīng)。按MMPs的作用底物可分為四大類，即膠原酶包括MMP-1、MMP-8、MMP-13；明膠酶包括MMP-2、MMP-9；基質(zhì)溶解酶包括MMP-3、MMP-7、MMP-10、MMP-11、MMP-12；模型MMPs包括MMP-14、MMP-15、MMP-16、MMP-17。膠原酶為水解活動(dòng)中最重要、最基本的酶類，只有膠原酶才能夠作用于膠原的螺旋區(qū)，膠原酶是基質(zhì)降解的關(guān)鍵酶〔1〕。目前為止發(fā)現(xiàn)與椎間盤退變相關(guān)的MMPs主要包括：MMP-1、2、3、7、8、9、13七種，其家族中其他成員在椎間盤中的表達(dá)鮮見報(bào)道。1982年，Sedowofia等首先在人類腰椎間盤纖維環(huán)和髓核組織提取物中發(fā)現(xiàn)了中性膠原酶、明膠酶和彈性蛋白酶，有研究發(fā)現(xiàn)突出的頸、腰椎間盤中MMP-3、明膠酶及白細(xì)胞介素(IL)-6的含量高于正常椎間盤。退變、突出椎間盤中MMP-3、IL-1的含量和表達(dá)陽性率高于正常椎間盤組〔2〕。Gaetani等〔3〕發(fā)現(xiàn)緊鄰神經(jīng)根的突出椎間盤組織中MMP-3含量高于椎體軟骨終板表面的椎間盤組織。

MMP-13屬于膠原酶的一種，主要降解Ⅱ型膠原，它在椎間盤退變之間存在密切的關(guān)系。Anderson等〔4〕損傷兔的椎間盤制作椎間盤退變模型后檢測MMP-13等多種炎癥介質(zhì)和相關(guān)酶類的mRNA的表達(dá)發(fā)現(xiàn)MMP-13表達(dá)明顯升高，而對照組沒有MMP-13的表達(dá)。Maitre等〔5〕將人的腰椎間盤退變標(biāo)本行免疫組化發(fā)現(xiàn)包括MMP-13在內(nèi)的多種MMPs均有表達(dá)，或者表達(dá)較正常椎間盤明顯增多，并隨退變程度而有所增加。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，正常椎間盤內(nèi)沒有MMP-13的表達(dá)，退變椎間盤內(nèi)表達(dá)較多。LeMaitre等〔6〕對IL-1和MMPs的表達(dá)之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)IL-1β能夠誘導(dǎo)人椎間盤細(xì)胞產(chǎn)生MMP-13，而對照組沒有MMP-13的產(chǎn)生。Yurube等〔7〕對兔椎間盤施加機(jī)械壓力制作的椎間盤退變模型后檢測蛋白酶類的基因表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)，MMP-13有所表達(dá)，而對照組沒有表達(dá)。以上研究均表明MMP-13參與了椎間盤退變的過程，而且多數(shù)學(xué)者認(rèn)為炎癥介質(zhì)和基質(zhì)酶類似乎有一種因果關(guān)系，炎癥介質(zhì)產(chǎn)生后就會(huì)導(dǎo)致基質(zhì)酶類的產(chǎn)生。本實(shí)驗(yàn)的第二部分已經(jīng)證實(shí)120 kD Fn-f誘導(dǎo)退變的椎間盤內(nèi)有MMP-13的表達(dá)。但是對于椎間盤內(nèi)MMP-13的來源仍不清楚，因此本部分實(shí)驗(yàn)對椎間盤細(xì)胞在120 kD Fn-f的誘導(dǎo)下能否產(chǎn)生MMP-13進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示軟骨終板細(xì)胞在120 kD Fn-f的誘導(dǎo)下，大量表達(dá)MMP-13 mRNA和MMP-13蛋白，表現(xiàn)為較亮電泳條帶和熒光顯色，說明軟骨細(xì)胞能夠表達(dá)MMP-13。纖維環(huán)細(xì)胞則表達(dá)量極少，幾乎不表達(dá)，說明纖維環(huán)細(xì)胞對120 kD Fn-f的刺激不敏感，或者說纖維環(huán)細(xì)胞本身不會(huì)大量表達(dá)MMP-13。由于髓核細(xì)胞和軟骨終板細(xì)胞更具有相似性，因此推測在120 kD Fn-f能夠誘導(dǎo)髓核細(xì)胞產(chǎn)生MMP-13，由于髓核細(xì)胞傳代沒有成功，因此只能推測。

4 參考文獻(xiàn)

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