九里香含藥血清抗軟骨細胞凋亡的機制

吳龍火 溫慧玲 李加林 郭小華

(贛南醫(yī)學院藥學院，江西 贛州 341000)

軟骨細胞發(fā)生過度凋亡是骨關(guān)節(jié)炎(OA)發(fā)病機制之一，但關(guān)于其分子調(diào)控機制還不是很清楚。九里香為蕓香科植物九里香的干燥葉和帶葉嫩枝，具有行氣止痛、活血散瘀、祛風除濕、麻醉鎮(zhèn)驚等功效〔1，2〕?，F(xiàn)代藥理學研究表明，九里香具有抗生育和終止妊娠、抗菌、抗甲狀腺腫大、降血糖、麻醉鎮(zhèn)靜及增強免疫功能等作用〔3〕。近年來有關(guān)九里香的實驗研究較多，但大多集中在化學成分等研究方面〔4～6〕。中藥發(fā)揮藥效學活性的物質(zhì)基礎(chǔ)，可能是中藥提取物中的原型成分，也可能是代謝產(chǎn)物，而只有被吸收入血的化學成分才可能是真正發(fā)揮藥效的活性物質(zhì)。

本課題組前期研究表明，九里香葉醇提物具有顯著的抗炎鎮(zhèn)痛活性，具有防治OA作用〔7〕。在中國藥典2010 年版中，只記載有九里香的顯微鑒別和理化鑒別〔8〕。目前，九里香藥材的特征圖譜尚未見報道，九里香中發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛活性的主要物質(zhì)基礎(chǔ)研究也較少。因此，本課題利用含藥血清培養(yǎng)OA軟骨細胞，分析其抗凋亡情況。

1 材料與方法

1.1材料 Agilent1100高效液相色譜儀(DAD檢測器，美國Agilent公司)；Sartorius BS214-D(北京賽多利斯系統(tǒng)有限公司)；AE240天平(十萬分之一)；XW-80A漩渦混合器(上海醫(yī)科大學儀器廠)；TGL-16G高速離心機(上海手術(shù)器械廠)。

乙腈為色譜純(TEDIA)；水為娃哈哈純凈水；其他試劑均為分析純試劑。九里香藥材采自福建漳州，經(jīng)贛南醫(yī)學院藥學院李加林老師鑒定為九里香的干燥葉和帶葉嫩枝。Wistar大鼠，雌雄各半，(200±20)g，均由贛州市實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(贛)2008-0002。

慈王村山林散養(yǎng)珍珠草雞產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，使得慈王村在經(jīng)濟發(fā)展的同時，其生態(tài)環(huán)境的改善，水土流失的防范和保護作用明顯，貧困村民對荒地、廢地的管理對慈王村的農(nóng)田、耕地起到了良好的屏障作用，對于維護生態(tài)平衡、改善全村生態(tài)環(huán)境、提高綜合生產(chǎn)能力、促進現(xiàn)代農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展起到積極的作用。

TRP通道的發(fā)現(xiàn)為疼痛治療開辟了一個嶄新的領(lǐng)域。與以往的鎮(zhèn)痛藥物不同，以TRP通道為靶點的新型鎮(zhèn)痛藥物能從源頭上消除疼痛的產(chǎn)生。但我們應(yīng)清楚地認識到，TRP通道組織分布廣泛，生理功能多樣，以此為靶點的藥物在發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的同時往往伴隨著副作用。TRPV1拮抗劑正是因為具有體溫過高的不良反應(yīng)而阻礙了其在臨床上的應(yīng)用。因此，減少此類藥物的不良反應(yīng)將是研發(fā)的難點。進一步研究TRP通道在疼痛中的作用對于闡明疼痛的發(fā)生機制、治療及相關(guān)藥物研發(fā)具有重要意義。

超寬帶接收機應(yīng)用到的器件，大部分都是寬帶或者高頻器件，這些射頻器件具有幅頻特性，其中寬帶放大器的增益隨著頻率的增高以6 dB每倍頻程下降[8-10]；無源器件的插損隨頻率的升高而增加；同型號的器件套間還存在變化斜率的差異，這些因素疊加起來會造成寬帶信道鏈路增益的波動可達10 db以上，嚴重影響了系統(tǒng)的正常使用。

術(shù)后正常飼養(yǎng)8 w，對其膝關(guān)節(jié)部分進行光學檢查。利用Ⅱ型膠原酶法配合胰蛋白酶進行消化分離，得到正常組及OA組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細胞后，分別用空白血清及含藥血清進行培養(yǎng)，利用流式細胞儀進行凋亡檢測。

1.2.1.2含藥血清樣品的制備 稱取九里香浸膏，溶于2%吐溫-80溶液，配制成劑量100 mg/kg給予大鼠灌胃。取Wistar大鼠(20只)，禁食12 h(自由飲水)，按照100 mg/kg劑量(中國藥典2010版推薦劑量)灌胃7 d，第八天灌胃后1 h，經(jīng)腹主動脈取血5 ml，靜置分離血清，以備培養(yǎng)軟骨細胞所用。取新鮮含藥血清5 ml，加入乙酸乙酯30 ml萃取3次，合并萃取液，蒸干，甲醇定容至200 μl，0.45 μm微孔濾膜濾過，以備HPLC檢測。

1.2.1.3空白血清樣品的制備 取Wistar大鼠(20只)，禁食12 h(自由飲水)，按照1.2.1.2項給予等體積的2%吐溫-80溶液灌胃7 d，第8天灌胃后1 h，經(jīng)腹主動脈取血5 ml，靜置分離血清，以備培養(yǎng)軟骨細胞所用。取新鮮含藥血清5 ml，加入乙酸乙酯30 ml萃取三次，合并萃取液，蒸干，甲醇定容至200 μl，0.45 μm微孔濾膜濾過，以備HPLC檢測。

1.2方法

（2）施工必須權(quán)責分明，使施工人員明確自己的職責，施工出現(xiàn)滲漏問題，往往都是施工不當所引起的所以，在施工中如果工程質(zhì)量出現(xiàn)了問題，要立刻能夠找出責任人，對其進行責任追究，這樣可以最大程度的減少施工質(zhì)量問題的出現(xiàn)。

1.2.2大鼠OA模型的建立及OA軟骨細胞的培養(yǎng) 每組6只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，參照文獻〔5〕復制大鼠實驗性O(shè)A模型。常規(guī)消毒，以3%戊巴比妥30 mg/kg腹腔注射麻醉后，仰臥于手術(shù)臺上，在無菌條件下在右膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)縱行切開約2 cm，逐層分離，將臏骨向后向外翻，最大限度屈曲膝關(guān)節(jié)，顯露膝關(guān)節(jié)腔。用顯微器械切斷前交叉韌帶、內(nèi)側(cè)負韌帶，完整切除內(nèi)側(cè)半月板后，逐層縫合傷口，分籠飼養(yǎng)，允許自由活動。術(shù)后給予青霉素10萬U肌肉注射抗炎，連續(xù)5 d。

1.2.1.1九里香浸膏樣品的制備 精密稱取九里香(粉碎，過100目篩)粉末約500 g，放入錐形瓶中，加入75%乙醇5 000 ml，回流提取2 h，濃縮至浸膏85.3 g。取浸膏8.5 g，加甲醇溶解定容至100 ml，過0.45 μm微孔濾膜過濾即得，以備建立指紋圖譜所用。

1.2.1樣品的制備

1.1 研究對象 收集2013年8月至2016年11月，在濰坊市婦幼保健院行NT、胎兒鼻骨超聲檢查的單胎胎兒資料共6 729例，存在超聲軟指標異常者共283例。

2.1九里香含藥血清的抗凋亡試驗 成功構(gòu)建大鼠OA模型。利用甲苯胺藍試劑對軟骨細胞進行鑒定(圖1)。流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，正常組的凋亡率為9.43%，OA模型未治療組的凋亡率為37.15%，九里香含藥血清組的軟骨細胞凋亡率為15.24%，說明九里香含藥血清大大降低了軟骨細胞的凋亡情況。

展會同期舉辦了2012中國水利工程機械發(fā)展論壇，以“‘十二五’水利基礎(chǔ)設(shè)施建設(shè)與發(fā)展”為主，以水利機械行業(yè)工作會議、中國工程機械租賃業(yè)頒獎慶典、水井鉆探設(shè)備及高效鉆進技術(shù)交流論壇三個專業(yè)性分論壇為輔，解讀“十二五”水利政策，探討水利建設(shè)前沿的技術(shù)與應(yīng)用，對各省水利項目投資與規(guī)劃、工程融資、設(shè)備租賃、新型科技等方面進行深入研討。年度“50強企業(yè)”“十大最具發(fā)展?jié)摿ζ髽I(yè)”“十大風云人物”“十大最具競爭力租賃品牌”的評選活動也在展會期間揭曉。

1.2.4人血成分的初步研究 進一步從原藥材中制備分離純化及進行結(jié)構(gòu)鑒定，通過紅外、紫外、質(zhì)譜和1HNMR和13CNMR進行表證。通過與血清學HPLC進行相對保留時間的比較。

2 結(jié) 果

1.2.3色譜條件 色譜柱為迪馬AgilentC18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈和水梯度洗脫系統(tǒng)；檢測波長為337 nm；柱溫為25 ℃；流速為1.0 ml/min；進樣量為20 μl?？疾觳煌荻认律V峰的分離度以及峰的數(shù)目。最后確定梯度洗脫程序為:0～5 min, 5%乙腈; 5～7 min, 18%乙腈;7～12 min, 18%乙腈; 12～22 min, 24%乙腈；22～30 min, 24%乙腈； 30～35 min, 35%乙腈；35～45 min, 35%乙腈；45～50 min, 50%乙腈；50～60 min，50%乙腈；60～80 min，100%乙腈。

2.2各供試樣品的HPLC指紋圖譜的建立 圖2可見，通過對HPLC色譜峰的對比，發(fā)現(xiàn)九里香含藥血清中有效成分達16種或以上，其中大多數(shù)為代謝成分；色譜峰1、3、4、7、9、11與九里香供試液HPLC對照圖譜對應(yīng)，為原型成分，色譜峰2、5、6、8、10、12、13、14、15、16在對照圖譜中未出現(xiàn)，推測可能均為代謝產(chǎn)物。

圖1 軟骨細胞凋亡的流式細胞圖

圖2 各供試樣品的HPLC指紋圖譜

2.3主要成分的結(jié)構(gòu)鑒定 分離得到的化合物A：白色粉末(乙醇-水)，mp：195℃～197℃，C19H18O6，紫外線下顯亮黃色熒光，鹽酸鎂粉反應(yīng)陽性，顯淡紫紅色。UV λmax(nm)：212，337。IR ν (cm-1)：3 401，1 647，1 605，1 516。EI-MS m/z：343〔M〕+。1H NMR(500 M Hz，CDCl3)：δ7.49(1H，dd，J=9.0，1. 8Hz，6’-H)，7.26(1H，d，J=1.8 Hz，2’-H)，6.92(1H，d，J=9.0 Hz，5’-H)，6.54(1H，s，3-H)，6.56(1H，d，J=2.4 Hz，8-H)，6.34(1H，d，J=2.4 Hz，6-H)，3.96(6H，brs，3’-OMe)，3.95(3H，s，4’-OMe)，3.94(3H，s，5-OMe)，3.90(3H，s，7-OMe)。13C NMR(100 mHz，CDCl3)：δ177.3(C-4)，164.8(C-7)，161.2(C-2)，160.8(C-5)，159.9(C-9)，152.4(C-4’)，148.6(C-3’)，125.2(C-1’)，119.7(C-6’)，112.1(C-5’)，110.3(C-10)，108.9(C-2’)，106.7(C-3)，97.3(C-6)，93.4(C-8)，57.1(OMe-4’)，56.8(OMe -5)，55.9(OMe -3’)，55.2(OMe -7)。結(jié)合以上數(shù)據(jù)分析，與文獻〔9〕基本一致，故確定該化合物為九里香酮。分離得到的化合物B：白色粉末(乙醇-水)，mp：118℃～120℃，C15H14O4。異羥肟酸鐵反應(yīng)陽性，紫外燈(365 nm)下呈藍色熒光。UV λmax(nm)：246，258，322。IR ν (cm-1)：2 964，1 713，1 608，1 498。EI-MS m/z：258 〔M〕+。1H NMR(500 mHz，CDCl3)：δ7.63(1H，d，J=10 Hz，4-H)，7.42(1H，d，J=8.5 Hz，5-H)，6.89(1H，d，J=8.7 Hz，6-H)，6.26(1H，d，J=10 Hz，3-H)，5.2(1H，s，4’ -H)，5.08(1H，s，4’ -H)，3.99(1H，d，J=2.0 Hz，1’-H)，3.97(3H，s，OMe)，3.92(1H，d，J=2.0 Hz，2’-H)，1.87(3H，s，5’-CH3)。13C NMR(100 mHz，CDCl3)：δ162.2(C-2)，160.6(C-7)，154.1(C-10)，143.6(C-3’)，141.6(C-4)，129.2(C-5)，113.7(C-8)，113.1(C-3)，112.8(C-9)，107.9(C-4’)， 60.9(C-2’)，56.6(C-6’)，52.1(C-1’)，17.7(C-5’)。結(jié)合以上數(shù)據(jù)分析，與文獻〔10〕基本一致，故確定該化合物為脫水長葉九里香內(nèi)酯(Phebalosin)。

九里香葉中分離得到的主要成分九里香酮和phebalosin的HPLC色譜圖分別對應(yīng)九里香供試液HPLC對照圖譜中的色譜峰9和11，其保留時間分別為40.277 min和47.585 min。見圖2。

3 討 論

本課題組的前期研究結(jié)果表明〔7〕，以75%乙醇回流提取2 h的方法最佳。對不同流動相系統(tǒng)及不同檢測波長的考察結(jié)果表明，本試驗在337 nm的檢測波長下，以乙腈-水系統(tǒng)梯度洗脫，樣品的大部分色譜峰基本分離。同時，對各供試液的穩(wěn)定性、儀器的精密度和測定方法的重復性進行了考察，均符合相關(guān)要求。

中藥血清藥物化學這種方法是建立在“只有入血成分才可能是藥效成分”的假說基礎(chǔ)之上的〔11〕，主要是通過分析給藥后存在于血清中的成分，確定中藥在動物體內(nèi)的直接作用物質(zhì)基礎(chǔ)；但它們也存在一些局限性〔12〕，如很難確定血清中檢測到的所謂“成分”是非活性成分還是活性成分的代謝產(chǎn)物，這些為分離帶來困難，也為空間結(jié)構(gòu)鑒定帶來困難。小分子化合物在血清中的存在方式可能是游離的，也可能是與轉(zhuǎn)運蛋白結(jié)合。在處理血清樣品時，考慮到處理方法對色譜峰的干擾影響〔13〕，本試驗采用直接加入乙酸乙酯進行多次萃取，合并有機相，干燥、蒸干、甲醇定容，以便獲得更多的信息。

九里香葉中的主要有效成分為黃酮類和香豆素類化合物。這兩大類化學結(jié)構(gòu)上的酚羥基大部分被醚化，總體極性屬于適中范圍〔14〕，大部分化合物的保留時間在20～ 60 min。

本實驗發(fā)現(xiàn)九里香血清藥物化學對OA軟骨細胞有明顯的抗凋亡作用。為進一步研究血清藥物化學的成分，我們利用HPLC進行中藥圖譜和血清圖譜的比對，分析血清中可能的化學成分變化。利用硅膠柱層析及半制備HPLC進行跟蹤導向分離得到兩個化合物，其相對保留時間與圖譜中色譜峰9和11基本一致。但色譜峰9和11與中藥中分離得到的化合物的相對保留時間一致并不能直接說明就是同一個化合物，需要進一步借用其他相關(guān)手段(如LC-MS等)進行鑒定。另外，對于其中特征峰的研究也有待進一步系統(tǒng)化，從整體上把握中藥內(nèi)“有效組分群”協(xié)同作用的特性〔15〕。

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