高血糖對(duì)全腦缺血再灌注大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響及PD98059的干預(yù)作用

李建民 趙雅寧 常學(xué)優(yōu) 劉 樂(lè)

(河北聯(lián)合大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，河北 唐山 063000)

研究發(fā)現(xiàn)高血糖不僅是腦梗死的最常見病因，同時(shí)，高血糖又增加了腦梗死的危險(xiǎn)性，加重腦缺血病理?yè)p傷，影響預(yù)后〔1〕。PD98059是絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)家族成員-細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2) 特異性抑制劑。MAPKs信號(hào)通路是連接大多數(shù)細(xì)胞外信號(hào)與膜受體、轉(zhuǎn)錄因子和各基因調(diào)節(jié)的中央信號(hào)通路，其家族成員包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)和p38 MAPK等。研究認(rèn)為ERK1/2信號(hào)激活后通過(guò)鏈?zhǔn)郊?jí)聯(lián)反應(yīng)，激活轉(zhuǎn)錄因子ATF-2、Elk-1、CHOP10等，調(diào)控細(xì)胞因子，凋亡基因的表達(dá)，對(duì)中樞神經(jīng)系的影響主要表現(xiàn)“雙刃劍”作用〔2，3〕。本研究建立高血糖大鼠全腦缺血再灌注損傷模型上，應(yīng)用PD98059進(jìn)行干預(yù)，觀察海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)、學(xué)習(xí)記憶功能的變化，以探討PD98059對(duì)高血糖大鼠腦缺血再灌注損傷后認(rèn)知功能的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SD大鼠120只，由北京維通利華公司提供，體重250～300 g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證編號(hào)：SCXK(京)2005-0013。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器與試劑 圖像采集及圖像分析系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad生物儀器設(shè)備公司)；八臂迷宮(淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司)；血糖儀(拜耳儀器設(shè)備有限公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 大鼠隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組(Sham，n=10)、全腦缺血再灌注組(IR，n=20)、高血糖+全腦缺血再灌注組(DCI，n=20)、高血糖+全腦缺血再灌注+PD98059抑制劑組(PD，n=20)。每組又隨機(jī)分為24 h、48 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)。采用改良的Pulsineli 4血管阻斷(4-VO)法〔3〕制作SD大鼠全腦缺血模型：動(dòng)物常規(guī)麻醉，頸正中切口,分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈,在其下置線備用。枕后部正中切開,暴露雙側(cè)第1頸椎橫突翼孔,直視下熱凝其下通過(guò)的椎動(dòng)脈，電凝每次時(shí)間約2～4 s，使翼小孔后雙側(cè)椎動(dòng)脈永久閉塞。術(shù)后大鼠縫皮回籠，24 h后以無(wú)創(chuàng)性微動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈，缺血30 min后松開動(dòng)脈夾，實(shí)行再灌注。缺血及再灌注期間用紅外線測(cè)溫儀監(jiān)測(cè)耳內(nèi)鼓膜溫度，并使之維持在(37±0.2)℃。Sham組分離暴露血管，但不電凝椎動(dòng)脈、不夾閉頸總動(dòng)脈。DCI模型：大鼠術(shù)前禁食12 h，按55 mg/kg腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)，72 h后空腹血糖超過(guò)16.7 mmol/L，有多尿、體質(zhì)量下降等表現(xiàn)的大鼠為高血糖大鼠后，按照上述IR模型進(jìn)行手術(shù)，方法同IR組。PD抑制劑組：高血糖大鼠復(fù)制成功后，在夾畢雙側(cè)頸總動(dòng)脈前2 h經(jīng)尾靜脈注射配制好的PD98059(0.3 mg/kg)其余手術(shù)方法同IR組。

1.4病理組織學(xué)檢測(cè) HE染色： 0.4 % 戊巴比妥鈉麻醉動(dòng)物，開胸、暴露心臟，4%多聚甲醛行心灌流，斷頭取腦，在視交叉后1 mm和6 mm處冠狀面切開，取中間塊入4%多聚甲醛固定液固定，石蠟包埋，切片(片厚5 μm)，蘇木精-伊紅染色。電鏡：動(dòng)物常規(guī)麻醉，混合固定液(2.5%戊二醛和2%多聚甲醛的磷酸緩沖液)心臟灌流，取海馬，切成1 mm ×1 mm ×1 mm 組織塊，立即以4 %戊二醛固定，0.1 mol/L二甲砷酸緩沖液沖洗兩遍，再經(jīng)1%四氧化鋨固定,緩沖液沖洗,逐級(jí)丙酮脫水,環(huán)氧樹脂浸透,包埋,超薄切片，醋酸鈾枸櫞酸鉛雙重染色。透射電鏡觀察腦組織超微結(jié)構(gòu)的變化。

1.5學(xué)習(xí)記憶功能檢測(cè) 八臂迷宮是一種比較理想的測(cè)試學(xué)習(xí)和記憶的模型，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物通過(guò)觀察周圍一些固定的參照物所提供的信息，來(lái)學(xué)習(xí)和記憶自身與餌(置于迷宮臂末端的食物)的相對(duì)位置。該方法不但可以有效地排除動(dòng)物由于自身運(yùn)動(dòng)機(jī)能障礙而對(duì)學(xué)習(xí)和記憶觀察指標(biāo)的影響，還可以同時(shí)分離和分析動(dòng)物工作記憶與參照記憶〔4〕。各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在晚8:00和早6：00分2次進(jìn)入八臂迷宮進(jìn)行學(xué)習(xí)和記憶行為功能檢測(cè)，每天每只動(dòng)物測(cè)試兩次，取均值。將大鼠放入迷宮內(nèi)，記數(shù)大鼠5 min內(nèi)搜索放置在八臂中的四個(gè)臂內(nèi)(1、3、5、7號(hào)臂)食物餌的規(guī)律：①總錯(cuò)誤次數(shù)(TTEF)，即大鼠進(jìn)入沒有餌的臂(包括已吃完和未放餌的臂)的次數(shù)；②工作記憶錯(cuò)誤次數(shù)(TWMEF)，工作記憶錯(cuò)誤是指大鼠再次進(jìn)入開始放有餌的臂的次數(shù)；③參考記憶錯(cuò)誤次數(shù)(TRMEF)，參考記憶錯(cuò)誤是指大鼠第1次進(jìn)入沒有放餌的臂的次數(shù)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1病理檢測(cè)結(jié)果 HE染色(表1)：Sham組海馬區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整，排列整齊致密，未見變性壞死的神經(jīng)元。IR組24和48 h時(shí)間點(diǎn)均可見海馬區(qū)變性壞死神經(jīng)元，表現(xiàn)為細(xì)胞間隙加大，細(xì)胞核濃縮、深染，溶解、消失，存活神經(jīng)元密度均明顯減少(P<0.05)；DCI組中海馬區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷加重，神經(jīng)元細(xì)胞存活密度進(jìn)一步降低(P<0.05)；PD組海馬區(qū)存活的神經(jīng)元較進(jìn)一步減少，視野內(nèi)較少正常的神經(jīng)細(xì)胞(P<0.05)。電鏡(圖1，圖2)：Sham組中神經(jīng)元內(nèi)可見正常細(xì)胞器,包括高爾基體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、多聚核糖體、線粒體、溶酶體等。神經(jīng)細(xì)胞軸索、微管正常；軸索結(jié)構(gòu)排列正常。IR組24和48 h時(shí)間點(diǎn)可見神經(jīng)細(xì)胞不同程度固縮，胞質(zhì)、胞核電子密度增高,核膜凹陷,高爾基體擴(kuò)張呈大泡狀,多聚核糖體解聚，高度腫脹、線粒體嵴斷裂或空泡化，雙膜結(jié)構(gòu)模糊或外膜破裂、消失，細(xì)胞器稀疏；軸索排列紊亂、腫脹，髓鞘泡鼓、內(nèi)折及分層，軸索變性、斷裂等。DCI組中神經(jīng)元細(xì)胞損傷進(jìn)一步加重，染色質(zhì)聚集明顯，基質(zhì)出現(xiàn)大量空泡，核膜模糊、凹陷，細(xì)胞器數(shù)量減少，僅見極少量細(xì)胞器，髓鞘嚴(yán)重分層，一些部位出現(xiàn)斷裂。PD組各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)元損傷現(xiàn)象進(jìn)一步加重，視野內(nèi)較少超微結(jié)構(gòu)正常的神經(jīng)細(xì)胞。

表1 各組大鼠海馬區(qū)存活神經(jīng)元密度比較±s,n=20)

圖1 各組大鼠缺血48 h海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)變化(×20 000)

圖2 各組大鼠缺血48 h海馬區(qū)髓鞘的形態(tài)變化(×20 000)

2.2學(xué)習(xí)記憶功能檢測(cè)結(jié)果 與Sham組比較，IR組動(dòng)物8次測(cè)試中總錯(cuò)誤次數(shù)和參考錯(cuò)誤次數(shù)增加(P<0.05)，與IR組比較，DCI組中大鼠總錯(cuò)誤次數(shù)、參考錯(cuò)誤次數(shù)和工作記憶次數(shù)增加(P<0.05)；與DCI組比較，PD組中總錯(cuò)誤次數(shù)和參考記憶錯(cuò)誤次數(shù)進(jìn)一步增多(P<0.05)，但工作記憶錯(cuò)誤次數(shù)無(wú)明顯變化(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶功能指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果比較±s,n=20)

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明高血糖可加重腦缺血的病理?yè)p傷及神經(jīng)功能的預(yù)后。與臨床相關(guān)報(bào)道一致。研究認(rèn)為高血糖加重缺血性腦損傷的機(jī)制與加劇對(duì)血腦屏障的破壞、惡化炎癥反應(yīng)、增加細(xì)胞凋亡等從而加重腦缺血再灌注損傷有關(guān)〔5，6〕。

PD98059是ERK1/2蛋白特異性抑制劑，可抑制ERK1/2/MAMPK信號(hào)通路的激活，該信號(hào)的特點(diǎn)是應(yīng)激激活后通過(guò)鏈?zhǔn)郊?jí)聯(lián)反應(yīng)，激活轉(zhuǎn)錄因子ATF-2、Elk-1、CHOP10等，調(diào)控細(xì)胞因子，凋亡基因的表達(dá)，參與多種病理和生理過(guò)程。目前關(guān)于ERK1/2信號(hào)通路在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的病理作用存有一定爭(zhēng)議。有學(xué)者認(rèn)為ERK1/2通過(guò)介導(dǎo)某些生長(zhǎng)因子轉(zhuǎn)錄如ELK-1、c-fos、c-myc等，促進(jìn)細(xì)胞的增殖、分化，影響突觸重塑，抑制死亡、促進(jìn)細(xì)胞存活而對(duì)神經(jīng)損傷后的形態(tài)和功能有保護(hù)作用〔7〕。也有觀點(diǎn)認(rèn)為ERK1/2信號(hào)可強(qiáng)化谷氨酸興奮性毒性作用、擴(kuò)大炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)、介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡從而加重腦缺血、癲癇、PD等病理?yè)p傷。海馬是大腦的重要結(jié)構(gòu),在學(xué)習(xí)和記憶功能以及調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌和自主神經(jīng)活動(dòng)中起重要作用〔8，9〕。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示,損毀雙側(cè)海馬可妨礙動(dòng)物視覺分辨學(xué)習(xí),使大鼠Y迷宮分辨學(xué)習(xí)和防御條件反應(yīng)的保持遭到嚴(yán)重的破壞〔10〕。本研究說(shuō)明PD98059進(jìn)一步加劇了高血糖對(duì)腦缺血?jiǎng)游锏纳窠?jīng)損傷，也提示ERK1/2作為內(nèi)源性啟動(dòng)的保護(hù)性蛋白參與高血糖加重腦缺血損傷病理進(jìn)程。本研究中，與DCI組比較，PD組中海馬區(qū)存活神經(jīng)元密度進(jìn)一步下降。結(jié)合文獻(xiàn)，我們認(rèn)為PD98059干擾ERK1/2信號(hào)通路的活化，抑制ERK1/2的促細(xì)胞存活信號(hào)的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的死亡，進(jìn)而加重了高血糖腦缺血?jiǎng)游锏膶W(xué)習(xí)記憶損傷。

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