外源性堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)Ⅲ級(jí)靜脈炎模型兔VEGF表達(dá)的影響

黃利全 陳 黎 毛宇飛 姜麗萍 陳桂園

(金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江 金華 321017)

堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)能促進(jìn)手術(shù)、外傷、炎癥、潰瘍等導(dǎo)致的組織和上皮的修復(fù)與再生，促進(jìn)傷口的無瘢痕復(fù)原〔1，2〕。大量研究證實(shí)，bFGF在創(chuàng)傷領(lǐng)域療效顯著，對(duì)新生血管的形成起效較快〔3〕，對(duì)心腦血管的損傷具有保護(hù)作用，但對(duì)靜脈炎癥導(dǎo)致血管損傷的作用未見報(bào)道。臨床資料顯示，靜脈炎是患者輸液反應(yīng)的常見并發(fā)癥，發(fā)生率高達(dá)80%〔4〕，其中Ⅲ級(jí)靜脈炎發(fā)生率為21.6%〔5〕。一旦發(fā)生Ⅲ級(jí)靜脈炎，患者血管嚴(yán)重?fù)p傷，甚至導(dǎo)致菌血癥的發(fā)生〔6，7〕，而當(dāng)前對(duì)重度靜脈炎的治療效果并不理想。本研究探討bFGF對(duì)Ⅲ級(jí)靜脈炎修復(fù)的作用。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器 一次性靜脈留置針(型號(hào)24G×19 mm)及3M透明敷貼分別由美國(guó)BD公司及3M公司生產(chǎn)；20%甘露醇產(chǎn)自華潤(rùn)雙鶴藥業(yè)股份有限公司；bFGF購自美國(guó)PeproTech 公司，50 μg/支。Leica DM 2000光學(xué)顯微鏡產(chǎn)自德國(guó)Leica公司； UCMOS09000KPA顯微鏡CCD成像系統(tǒng)產(chǎn)自杭州圖譜光電科技有限公司。

1.2建模與分組 選健康新西蘭同種家兔42只，體重2.5～3.0 kg，雌雄各半，由金華市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供〔生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK(浙)2010-0151〕，單籠飼養(yǎng)，隨機(jī)編號(hào)、排序。按隨機(jī)數(shù)字表法分5組：bFGF組、硫酸鎂組、生理鹽水組各12只；正常組、模型組各3只。正常組行剃毛和雙耳包扎，余4組取兔雙耳外緣靜脈為實(shí)驗(yàn)血管，由專人統(tǒng)一操作，用24G留置針一次穿刺成功后3M透明貼及自制兔套固定。每日在15 min內(nèi)推注20%甘露醇10 ml，常規(guī)肝素鹽水2 ml(25 U/ml)正壓封管，觀察穿刺血管情況，形成Ⅲ級(jí)靜脈炎為建模成功。預(yù)實(shí)驗(yàn)示建模成功時(shí)間為5 d，故留置5 d后拔管，未達(dá)Ⅲ級(jí)靜脈炎者廢棄、重新補(bǔ)入。

1.3干預(yù)與標(biāo)本制作 建模成功后拔靜脈留置針， bFGF組于拔管日在炎癥靜脈右側(cè)旁開0.25 cm處皮下注射bFGF 0.8 μg/kg 1次。硫酸鎂組及生理鹽水組分別用50%硫酸鎂或生理鹽水的六層濕紗布(以不滴水為度)覆蓋靜脈炎局部，3次/d，15 min/次，一旦紗布變干馬上更換。正常組、模型組于拔管日，余三組在用藥后24、72、120、168 h分別提取標(biāo)本。各時(shí)相各取3只家兔在苯巴比妥鈉腹腔麻醉下提取活體標(biāo)本，以穿刺點(diǎn)及留置針套管末端為中心，截取長(zhǎng)、寬各0.5 cm的兩段標(biāo)本，經(jīng)10%中性甲醛液固定24 h 后, 常規(guī)制蠟，連續(xù)切片。每張切片厚度約2～5 μm,其中第4張切片行血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)檢測(cè)，前后連續(xù)的5張切片行HE染色。

1.4病理觀察與免疫組化檢測(cè) HE染色后由病理科醫(yī)生鏡下觀察血管內(nèi)皮腫脹、炎細(xì)胞浸潤(rùn)、管壁增厚、纖維增生、血栓形成等情況。

一抗VEGF兔抗多克隆抗體，二抗聚合HRP標(biāo)記抗兔IgG，SV試劑盒(含DAB顯色劑)均購自武漢博士德生物技術(shù)公司。一抗稀釋倍數(shù)為1∶100，嚴(yán)格按照試劑說明書步驟操作。免疫組化結(jié)果判定， VEGF陽性表達(dá)位于細(xì)胞質(zhì)，出現(xiàn)明顯的黃色和棕黃色為陽性細(xì)胞。陰性對(duì)照以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色,蘇木素復(fù)染。陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)參照王艷艷等〔8〕的觀察法，每組隨機(jī)選取5張切片，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)不重疊的高倍視野(×200)，計(jì)數(shù)視野中的陽性細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算每組平均每個(gè)高倍視野中的陽性細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1病理學(xué)表現(xiàn) bFGF組用藥后24 h血管腔內(nèi)少見血栓，內(nèi)皮細(xì)胞增生明顯；120 h新生的內(nèi)皮細(xì)胞相互連接成完整的內(nèi)皮，血管腔內(nèi)血栓及炎性滲出物吸收，基本恢復(fù)正常。硫酸鎂組120 h血管腔內(nèi)炎性細(xì)胞減少，新生內(nèi)皮細(xì)胞少；168 h炎癥消退較明顯。生理鹽水組120 h管腔內(nèi)炎性細(xì)胞仍明顯，168 h炎癥略有消退。正常組血管壁光滑，無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組血管壁被大量淋巴細(xì)胞、組織細(xì)胞侵蝕，肌纖維母細(xì)胞增生，血管腔內(nèi)混合血栓形成，管腔周圍炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1)。

2.2VEGF蛋白的表達(dá) VEGF陽性表達(dá)主要集中在內(nèi)皮細(xì)胞的胞質(zhì)中。bFGF組VEGF表達(dá)強(qiáng)陽性，24 h最高，72～120 h表達(dá)處于一個(gè)較高水平，168 h VEGF陽性表達(dá)下降，與模型組、硫酸鎂組及生理鹽水組間兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。硫酸鎂組VEGF表達(dá)量24 h較多，其余時(shí)相與生理鹽水組相近均為陰性表達(dá)，與bFGF組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。正常組、模型組VEGF弱陽性表達(dá)，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖2，表1)。

A:正常組;B:模型組;C:bFGF組(24 h);D: bFGF組(120 h);E:硫酸鎂組(120 h);F:生理鹽水組(120 h)

圖2 靜脈炎各組VEGF表達(dá)情況(SP，×200)

組別24 h72 h120 h168 hbFGF組73.40±1.821)2)50.40±5.131)2)57.20±5.811)2)37.20±2.781)2)破酸鎂組32.00± 8.091)20.00±1.2315.80±1.4819.40±2.51生理鹽水組16.60±3.5820.20±2.6821.80±0.8411.80±1.30F值158.6207.173205.131162.382 P值0.0000.0090.0000.000

3 討 論

Ⅲ級(jí)靜脈炎屬于重度靜脈炎，肉眼可見輸液部位疼痛伴有發(fā)紅或水腫，可觸及條索狀靜脈，臨床處理較棘手。本研究采用靜脈留置針的機(jī)械刺激與20%甘露醇的高滲透刺激雙重作用下誘導(dǎo)建立除疼痛因素外的Ⅲ級(jí)靜脈炎動(dòng)物模型，為該級(jí)靜脈炎的病理觀察及不同藥物的干預(yù)研究提供了可能。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)雙重因素作用下Ⅲ級(jí)靜脈炎的形成時(shí)間約為5 d，與梁月香等〔9〕的臨床觀察結(jié)果相似。此時(shí)除肉眼變化外病理可見血管腔內(nèi)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，混合血栓形成，內(nèi)皮細(xì)胞壞死脫落，血管壁增厚。因正常內(nèi)皮細(xì)胞具有抗炎抗凝屬性〔10〕，一旦受損即致炎癥反應(yīng)發(fā)生及血栓形成，故損傷部位血管的再內(nèi)皮化是靜脈炎修復(fù)的關(guān)鍵。

本研究結(jié)果顯示bFGF加速了修復(fù)的進(jìn)程，縮短了治愈時(shí)間。盡管正常血管內(nèi)膜損傷時(shí)也能分泌bFGF，但分泌量不足，修復(fù)進(jìn)程緩慢需1～2 w。當(dāng)加用外源性bFGF時(shí)，增加了局部bFGF含量并通過激活內(nèi)源性生長(zhǎng)因子活性或上調(diào)生長(zhǎng)因子受體表達(dá)〔11〕，使VEGF分泌量驟升。VEGF作為促血管生成的生長(zhǎng)因子，受缺氧及其他因素的影響，由內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血小板、中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等分泌產(chǎn)生，具有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂、趨化等功能。Ⅲ級(jí)靜脈炎時(shí)，局部血管缺氧，再加bFGF與VEGF的正協(xié)同作用〔12〕，加速了血管內(nèi)膜的內(nèi)皮化，抑制了血栓的形成〔13〕。

本文VEGF的表達(dá)高峰時(shí)間與Brown等〔14〕和Frank等〔15〕報(bào)道VEGF表達(dá)高峰時(shí)間與損傷程度相關(guān)的結(jié)果相符，可見Ⅲ級(jí)靜脈炎損傷較嚴(yán)重。本文中bFGF組高水平的VEGF維持時(shí)間顯著長(zhǎng)于硫酸鎂組，分析原因可能與內(nèi)源性bFGF迅速處于低值有關(guān)〔16，17〕,此時(shí)主要依賴外源性bFGF誘導(dǎo)VEGF表達(dá)。盡管硫酸鎂組VEGF的整體表達(dá)量不高，但靜脈炎癥消退仍較明顯，其作用機(jī)制可能是通過其高滲性及Mg2+擴(kuò)張局部血管而達(dá)到消腫作用。本實(shí)驗(yàn)中生理鹽水組VEGF分泌量低下，這與文獻(xiàn)結(jié)果認(rèn)為損傷早期以VEGF表達(dá)為主〔18〕不符合，分析原因可能與炎癥早期Ⅲ級(jí)靜脈炎損傷嚴(yán)重，導(dǎo)致VEGF表達(dá)欠佳有關(guān)，又可能與損傷晚期以內(nèi)源性bFGF表達(dá)為主有關(guān)〔18〕。

綜上所述，bFGF與硫酸鎂對(duì)Ⅲ級(jí)靜脈炎均有修復(fù)作用，bFGF優(yōu)于硫酸鎂。其作用機(jī)制可能是Ⅲ級(jí)靜脈炎時(shí)血管內(nèi)皮細(xì)胞嚴(yán)重受損，激活了巨噬細(xì)胞，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、內(nèi)皮細(xì)胞壞死脫落。bFGF通過激活內(nèi)源性生長(zhǎng)因子活性或上調(diào)生長(zhǎng)因子受體表達(dá), 進(jìn)而協(xié)同VEGF共同發(fā)揮促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生的功能。

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