KLK6、KLK10在結(jié)直腸癌的表達及與臨床病理的關系

呂 洋 李鳳玉 任君旭 劉 博

(河北北方學院基礎醫(yī)學院組胚教研室，河北 張家口 075000)

人組織激肽釋放酶家族(KLKs)是胰凝乳蛋白酶家族絲氨酸蛋白酶的亞家族，廣泛存在于人體多種生理組織和體液中。KLK6及KLK10均是KLKs的成員。近來研究發(fā)現(xiàn)，KLK6及KLK10參與包括結(jié)直腸癌存在的多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展〔1～4〕。本研究應用免疫組織化學方法，檢測二者在結(jié)直腸腺癌、腺瘤和正常結(jié)直腸黏膜組織中的表達，回顧性研究KLKs與結(jié)直腸癌臨床病理的關系及可能機制。

1 材料和方法

1.1研究對象 采用隨機法從河北北方學院附屬第一醫(yī)院病理科2008年1月1日至2011年12月31日手術切除原發(fā)性結(jié)直腸腺癌437例石蠟包埋標本中選取57例，所有患者術前均未經(jīng)過任何治療且均有完整的臨床病理資料。入選病例有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明確，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例要求送檢淋巴結(jié)數(shù)目≥12枚，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例至少有1枚淋巴結(jié)被病理證實有癌轉(zhuǎn)移。同時選取結(jié)直腸腺瘤石蠟標本21例，距癌組織>5 cm的正常黏膜組織共11例作為對照，對照標本經(jīng)病理證實無腫瘤細胞浸潤，無明顯炎癥，無明顯細胞增生等病變。57例結(jié)直腸癌標本中，男33例，女24例，年齡22～78歲，中位年齡56.0為，平均年齡為55.2歲。腫瘤直徑≤5 cm的31例(54.4%)，>5 cm的26例(45.6%)；分化程度為高分化的14例，中分化22例，低分化21例；TNM分期為Ⅰ期的5例，Ⅱ期17例，Ⅲ期22例；Ⅳ期13例。

1.2試劑及方法 兔抗人KLK6多克隆抗體(工作濃度為1∶100)、兔抗人KLK10多克隆抗體(工作濃度為1∶200)均購自北京博奧森生物技術有限公司；S-P試劑盒、檸檬酸抗原修復緩沖液、 PBS緩沖液、抗體稀釋液、DAB顯色劑均購自石家莊勃盛化學試劑有限公司。按照S-P免疫組化檢測試劑盒中的操作方法并用高壓鍋抗原修復技術檢測KLK6及KLK10在結(jié)直腸癌中的表達。PBS 緩沖液代替一抗作陰性對照。

1.3結(jié)果判斷 KLK6及KLK10的蛋白陽性產(chǎn)物均主要表達于細胞質(zhì)。出現(xiàn)灰黃色、金黃色或棕黃色顆粒記為陽性細胞，依陽性細胞占所觀察細胞的百分比及著色強度綜合計分〔5〕。由兩位病理醫(yī)師分別雙盲閱片，隨機選取5個高倍鏡視野計數(shù)陽性細胞百分比的平均數(shù)，按腫瘤細胞陽性細胞數(shù)量記為0～3分，陽性細胞數(shù)目為<10%為0分，10%～49%為1分，50%～74%為2分，≥75%為3分；著色強度記為0～3分，無色為0分，灰黃色為1分，金黃色為2分，棕黃色為3分；將兩項指標的評分相加，根據(jù)總的分數(shù)分為2級，0～2分為陰性，≥3分為陽性。

1.4統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0軟件進行χ2檢驗、Spearman等級相關分析。

2 結(jié) 果

2.1KLK6及KLK10在不同結(jié)直腸黏膜組織中的表達情況 與陰性對照實驗結(jié)果相比，KLK6及KLK10在正常結(jié)直腸黏膜組織中多呈陰性表達，在腺瘤組織中表達增強，在結(jié)直腸腺癌中表達明顯(圖1)。KLK6及KLK10在結(jié)直腸腺癌的陽性率分別為52.6%和66.7%，在結(jié)直腸腺瘤的陽性率分別為33.3%和38.1%，在正常結(jié)直腸黏膜組織中的陽性率為9.1%和27.3%。KLK6及KLK10在結(jié)直腸腺癌、結(jié)直腸腺瘤及正常結(jié)直腸黏膜組織中的表達均具有顯著差異(χ2=8.129和8.978，P均<0.05)。見表1。

2.2KLK6及KLK10的表達與結(jié)直腸腺癌患者臨床病理特征的關系 見表2。KLK6及KLK10的表達均與患者的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及肝轉(zhuǎn)移情況相關(P均<0.05)。TNM分期高、伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及肝轉(zhuǎn)移的患者KLK6及KLK10的表達均強。此外，KLK6還與腫瘤的分化程度相關，低分化的結(jié)直腸癌KLK6蛋白表達高(P=0.015)。而KLK6及KLK10的陽性表達與患者的性別、年齡、腫瘤大小等均不相關(P均>0.05)。

正常結(jié)直腸黏膜KLK6

結(jié)直腸腺瘤KLK6

結(jié)直腸腺癌KLK6

陰性對照組

正常結(jié)直腸黏膜KLK10

結(jié)直腸腺瘤KLK10

結(jié)直腸腺癌KLK10

圖1各種結(jié)直腸黏膜組織KLK6、KLK10表達(SP，×200)

表1 KLK6和KLK10在結(jié)直腸腺癌、腺瘤和正常黏膜組織中的表達〔n(%)〕

表2 KLK6和KLK10陽性表達與臨床病理情況的關系

2.3KLK6及KLK10在結(jié)直腸癌表達的相互關系 KLK6及KLK10在結(jié)直腸癌的表達呈正相關(r=0.745)。KLK10在KLK6陽性組中的表達(陽性率100%)明顯高于在KLK6陰性組中的表達(陽性率29.6%)。

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，KLKs參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，主要方式為通過其編碼的hK蛋白直接或間接的降解腫瘤細胞外基質(zhì)蛋白如膠原蛋白，纖連黏連蛋白，層黏連蛋白等，從而促進腫瘤細胞的遷移、腫瘤新生血管的形成。

KLK6基因是KLKs成員之一，編碼由223個氨基酸組成、具有胰蛋白酶樣活性的hK6蛋白。國外學者通過EST數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)KLK6在女性生殖系統(tǒng)如卵巢、子宮和消化系統(tǒng)如食管、胃、胰腺等腫瘤中表達上調(diào)，在乳腺和腦部腫瘤中表達下調(diào)〔6〕。關于KLK6與結(jié)直腸癌的研究，Ogawa等〔7〕采用RT-PCR技術發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌組織中 KLK6 mRNA表達水平明顯高于正常組織， KLK6 mRNA高表達與腫瘤漿膜浸潤、肝轉(zhuǎn)移、臨床分期、預后差相關。Kim等〔8〕研究發(fā)現(xiàn)， KLK6 mRNA在結(jié)直腸癌患者組織及血清中的表達水平顯著增高，且與患者的預后不良密切相關。本研究結(jié)果顯示，KLK6在結(jié)直腸腺癌、結(jié)直腸腺瘤及正常結(jié)直腸黏膜組織中的表達具有顯著差異。進一步與臨床病理的關聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)，KLK6的表達與患者的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移情況及腫瘤的分化程度相關。分化程度低、TNM分期高、伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及肝轉(zhuǎn)移的患者KLK6的表達均強，這一結(jié)果與Petraki等〔9〕的結(jié)果一致。

KLK10基因位于19號染色體q13.4位置上， 含6個外顯子(其中一個未被翻譯)和5個內(nèi)含子，編碼一條分子量約為30 kD的含276 個氨基酸的蛋白。近年大量研究顯示，在激素相關性組織發(fā)生的腫瘤如乳腺癌、前列腺、睪丸癌中KLK10 表達異常，多數(shù)病例表達下降，也有少數(shù)表達異常升高，高表達則提示預后不良〔10〕。KLK10在激素相關性組織發(fā)生的腫瘤中異常表達可能與性激素分泌失衡相關〔11〕。此外，有學者發(fā)現(xiàn)KLK10在結(jié)直腸癌中也呈異常高表達，且與結(jié)直腸癌患者的腫瘤分期及肝臟轉(zhuǎn)移密切相關〔12，13〕。本研究結(jié)果顯示，KLK10在結(jié)直腸腺癌、腺瘤及正常結(jié)直腸黏膜組織中的表達具有顯著性差異。伴有淋巴結(jié)及肝臟轉(zhuǎn)移、TNM分期越高的患者KLK10的表達越強。而KLK10陽性表達與患者的性別、年齡、腫瘤大小、分化程度等均不相關。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，KLK6及KLK10基因在多種腫瘤中表達結(jié)果相一致，如在前列腺癌中KLK6及KLK10的表達均下調(diào)〔14〕，在卵巢癌組織中二者則均呈過表達〔15〕。在乳腺癌和淋巴細胞白血病中KLK6及KLK10的表達異常均是由于二者高度甲基化的CpG島引起的〔16〕。本研究結(jié)果也顯示，KLK6及KLK10在結(jié)直腸癌的表達呈正相關，KLK10在KLK6陽性組中的表達率明顯高于在KLK6陰性組中的表達率。由此推測在KLKs中，KLK6及KLK10在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中可能起到了協(xié)同作用，但具體機制仍不清楚，仍需要進一步的研究。

綜上所述，KLK6及KLK10參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展并與結(jié)直腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移及TNM分期相關，可作為較為理想的腫瘤標志物輔助判斷患者預后并指導臨床治療。

4 參考文獻

1Rückert F,Hennig M,Petraki CD,etal.Co-expression of KLK6 and KLK10 as prognostic factors for survival in pancreatic ductal adenocarcinoma〔J〕.Br J Cancer，2008；99(9):1484-92.

2El Sherbini MA,Sallam MM,Shaban EA,etal.Diagnostic value of serum kallikrein-related peptidases 6 and 10 versus CA125 in ovarian cancer〔J〕.Int J Gynecol Cancer，2011；21(4):625-32.

3Koh SC,Razvi K,Chan YH,etal.The association with age,human tissue kallikreins 6 and 10 and hemostatic markers for survival outcome from epithelial ovarian cancer〔J〕.Arch Gynecol Obstet，2011；284(1):183-90.

4陳 玲.人激肽釋放酶6,7,10在卵巢癌組織中的表達及臨床意義〔J〕.江蘇大學學報(醫(yī)學版),2011；21(5):428-34.

5許良中，楊文濤.免疫組織化學反應結(jié)果的判斷標準〔J〕.中國癌癥雜志，1996；6(4)：229-31.

6Yousef GM,Borgoo CA,White NM,etal.In silico analysis of the human kallikrein gene 6〔J〕.Tumour Biol，2004；25(5-6)：282-9.

7Ogawa K,Utsunomiya T,Mimori K,etal.Clinical significance of human kallikrein gene 6 messenger RNA expression in colorectal cancer〔J〕.Clin Cancer Res，2005；11(8):2889-93.

8Kim JT,Song EY,Chung KS,etal.Up-regulation and clinical significance of serine protease kallikrein 6 in colon cancer〔J〕.Cancer，2011；117(12):2608-19.

9Petraki C,Dubinski W,Scorilas A,etal.Evaluation and prognostic significance of human tissue kallikrein-related peptidase 6(KLK6)in colorectal cancer〔J〕.Pathol Res Pract，2012；208(2):104-8.

10Luo LY,Diamandis EP,Look MP,etal.Higher expression of human kallikrein 10 in breast cancer tissue predicts tamoxifen resistance〔J〕.Br Cancer,2002；86(11)：1790-6.

11靖吉麗.人組織激肽釋放酶10在宮頸癌組織中的表達及臨床意義〔D〕.長春：吉林大學碩士學位論文，2011：4-5.

12Talieri M,Alexopoulou DK,Scorilas A,etal.Expression analysis and clinical evaluation of kallikrein-related peptidase 10(KLK10)in colorectal cancer〔J〕.Tumour Biol，2011；32(4):737-44.

13馮 波,鄭民華,馬君俊，等.結(jié)直腸癌組織中激肽釋放酶10基因的表達及其與臨床及病理的關系〔J〕.中華外科雜志,2006；44(9)：623-7.

14Nakamura T,Mitsui S,Okui A,etal.Alternative splicing isoforms of hippostasin(PRSS20/KLK11)in prostate cancer cell lines〔J〕.Prostate，2001；49(1):72-8.

15Shvartsman HS,Lu KH,Lee J,etal.Overexpression of kallikrein 10 in epithelial ovarian carcinomas〔J〕.Gynecol Oncol，2003；90(1):44-50.

16Emami N,Diamandis EP.New insights into the functional mechanisms and clinical applications of the kallikrein-related peptidase family〔J〕.Mol Oncol,2007；1(3):269-87.