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    葛花總黃酮對阿霉素所致中毒性心肌炎的保護(hù)作用研究

    2014-09-13 07:14:42徐慶國談金強宋希林陳沅
    中國生化藥物雜志 2014年7期
    關(guān)鍵詞:阿霉素心肌細(xì)胞黃酮

    徐慶國,談金強,宋希林,陳沅

    (1.山東省交通醫(yī)院心內(nèi)科,山東濟(jì)南250031;2.山東省濟(jì)陽縣人民醫(yī)院心內(nèi)科,山東濟(jì)陽251400;3.山東省腫瘤醫(yī)院胃腸外科,山東濟(jì)南250012;4.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院心內(nèi)科,重慶400010)

    葛花總黃酮對阿霉素所致中毒性心肌炎的保護(hù)作用研究

    徐慶國1,談金強2,宋希林3,陳沅4

    (1.山東省交通醫(yī)院心內(nèi)科,山東濟(jì)南250031;2.山東省濟(jì)陽縣人民醫(yī)院心內(nèi)科,山東濟(jì)陽251400;3.山東省腫瘤醫(yī)院胃腸外科,山東濟(jì)南250012;4.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院心內(nèi)科,重慶400010)

    目的探討葛花總黃酮對阿霉素中毒性心肌炎的保護(hù)作用及其機制。方法健康昆明種小鼠96只,雄雌不拘,分為6組,每組16只。正常對照組(control):每天經(jīng)口灌胃(ig)生理鹽水(NS)20mL/kg,并于實驗第2天起,腹腔注射(ip)NS 10mL/kg,隔天1次,共7次;阿霉素模型對照組(model):每天ig 20mL/kg NS,同時于實驗第2天起,ip阿霉素3mg/kg,隔天1次,共7次;阿霉素+葛花總黃酮小劑量組(50mg/kg);阿霉素+葛花總黃酮中劑量組(100mg/kg);阿霉素+葛花總黃酮大劑量組(200mg/kg);維生素E陽性對照組(Vit E):造模同阿霉素模型對照組,同時每天ig Vit E 0.04 g/kg。阿霉素+葛花總黃酮各組的造模方法同阿霉素模型對照組,同時每天分別ig葛花總黃酮相應(yīng)劑量,各組實驗連續(xù)進(jìn)行15 d。采用HE染色檢測心肌組織結(jié)構(gòu)變化,采用免疫組織法檢測心肌組織凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2表達(dá)情況,并進(jìn)行組織學(xué)檢查,觀察心肌結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果與正常對照組比較,阿霉素(3mg/kg,ip,7次)可致小鼠血清肌酸激酶(CK)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)、乳酸脫氫酶(LDH)和iNOS活力均顯著升高(P<0.01),同時使心肌丙二醛(MDA)含量明顯上升(P<0.01),而超氧化物歧化酶(SOD)活力則顯著下降(P<0.01)。另外,小鼠心肌細(xì)胞凋亡數(shù)明顯升高,細(xì)胞凋亡率達(dá)(40.5±5.2)%,凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2含量均明顯升高,與正常對照組比較差異有顯著性(P<0.01),但Bcl-2/Bax值降低。葛花總黃酮(50、100、200mg/kg,15 d)和Vit E組劑量依賴性的逆轉(zhuǎn)阿霉素所致的上述改變,表現(xiàn)為降低小鼠血清CK、GOT、LDH和iNOS活力,降低心肌MDA含量和增加SOD活力,降低促凋亡基因Bax蛋白表達(dá),使Bcl-2/Bax值增加,尤其以高劑量組作用最為明顯。光鏡和電鏡結(jié)果對心肌形態(tài)學(xué)的觀察也證實了葛花總黃酮對阿霉素中毒性心肌炎保護(hù)作用。結(jié)論阿霉素可以誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡,引起實驗小鼠中毒性心肌炎。葛花總黃酮能拮抗阿霉素所致的心肌損傷,其作用機制與增強心肌SOD活力和抗心肌脂質(zhì)過氧化、降低凋亡基因Bax蛋白表達(dá)等有關(guān)。

    葛花總黃酮;阿霉素;脂質(zhì)過氧化;細(xì)胞凋亡;Bax;Bcl-2;

    阿霉素(adriamycin,ADR)屬于蒽環(huán)類抗生素[1],從松鏈絲菌淺灰色變株(Str.peucetius-var.caseus)中提取,有一個四環(huán)的發(fā)色基團(tuán),第14位C加上一個羥基(-OH)[2]。從20世紀(jì)60年代開始,阿霉素廣泛用于白血病、惡性淋巴瘤、乳癌、肺癌等多種癌癥的治療,是一種高效的廣譜抗腫瘤藥物,其療效顯著,且價格相對低廉,至今仍然是臨床一線抗癌用藥物[3-7]。本實驗首先提取、分離葛花中的黃酮類化合物,并測定其總黃酮的產(chǎn)率和濃度;然后再通過建立阿霉素中毒性心肌炎小鼠模型,研究葛花總黃酮對阿霉素所致中毒性心肌炎的保護(hù)作用及其機制。

    1 材料與方法

    1.1 主要藥品與試劑 干葛花(經(jīng)鑒定為豆科蝶形花亞科葛屬植物野葛的干燥花蕾,江西省橫峰縣葛源鎮(zhèn)葛源綠山葛粉廠)。注射用鹽酸阿霉素(鹽酸多柔比星),浙江海正藥業(yè)股份有限公司,每瓶10mg。維生素E(Vit E)膠丸,浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠,每粒100mg,用植物油溶解配制。乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)、肌酸激酶(creatine kinase,CK)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(glutamic oxaloacetic transaminase,GOT)、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(induciblenitric oxide synthase,iNOS)測試盒均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。原位細(xì)胞死亡檢測試劑盒為德國寶靈曼公司產(chǎn)品。Bcl-2、Bax多克隆抗體試劑盒為武漢博士德公司產(chǎn)品。

    1.2 實驗動物 健康昆明種小鼠96只,動物許可證號:SCXK-(吉)2003-20 l4,雄雌不拘,分為6組,每組16只,體質(zhì)量25~30 g。動物室飼養(yǎng)溫度(23±2)℃、濕度0.50~0.60、人工光照明暗各12 h,標(biāo)準(zhǔn)飼料。本實驗遵循《實驗動物保護(hù)條例》。

    1.3 實驗方法

    ①正常對照組(control):每天經(jīng)口灌胃(ig)生理鹽水(NS)20mL/kg,并于實驗第2天起,腹腔注射(ip)NS 10mL/kg,隔天1次,共7次;

    ②阿霉素模型對照組(model):每天ig 20mL/kg NS,同時于實驗第2天起,ip阿霉素3mg/kg,隔天1次,共7次;

    ③阿霉素+葛花總黃酮小劑量組(50 mg/kg):每天ig 50 mL/kg NS,同時于實驗第2天起,ip阿霉素50mg/kg,隔天1次,連續(xù)進(jìn)行15 d;

    ④阿霉素+葛花總黃酮中劑量組(100mg/kg):每天ig 100 mL/kg NS,同時于實驗第2天起,ip阿霉素100 mg/kg,隔天1次,連續(xù)進(jìn)行15 d;

    ⑤阿霉素+葛花總黃酮大劑量組(200mg/kg):每天ig 200 mL/kg NS,同時于實驗第2天起,ip阿霉素200 mg/kg,隔天1次,連續(xù)進(jìn)行15 d;

    ⑥維生素E陽性對照組(Vit E):造模同第②組,同時每天ig Vit E 0.04 g/kg。

    阿霉素+葛花總黃酮各組的造模方法同第②組,同時每天分別ig葛花總黃酮相應(yīng)劑量,各組實驗連續(xù)進(jìn)行15 d。采用HE染色檢測心肌組織結(jié)構(gòu)變化,采用免疫組織法檢測心肌組織凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2表達(dá)情況,并進(jìn)行組織學(xué)檢查,觀察心肌結(jié)構(gòu)變化。

    2 結(jié)果

    2.1 小鼠一般情況與存活率 小鼠一般情況與存活率:正常對照組小鼠精神活動狀況良好,進(jìn)食正常,體質(zhì)量增長正常,未出現(xiàn)死亡。阿霉素模型對照組小鼠第6天后活動減少,攝食減少,步態(tài)蹣跚,精神萎靡,體質(zhì)量開始下降,10 d時體質(zhì)量降低明顯,被捕捉時掙扎少,少數(shù)出現(xiàn)腹瀉腹脹中毒癥狀;第12天以后出現(xiàn)死亡,解剖可見胸腔和腹腔均有少量積液,腸道脹氣多見。葛花各劑量組和Vit E組小鼠精神狀況比阿霉素模型對照組好,但與正常對照組相比,一般情況較差,各組小鼠存活率見表1。

    表1 各組小鼠存活率比較Tab.1 Groups ofmice survival rate

    2.2 小鼠各組心臟質(zhì)量/體質(zhì)量比(HW/BW) 各組心臟質(zhì)量/體質(zhì)量比(HW/BW):實驗結(jié)束后,阿霉素模型對照組和葛花小劑量組HW/BW明顯降低,和正常對照組比較差異均有顯著性(P<0.05)。葛花總黃酮和Vit E可使HW/BW比值升高,尤其是葛花高劑量組作用較為明顯,與阿霉素模型對照組比較差異均有顯著性(P<0.05)。

    表2 各組小鼠HW/BW的變化比較(n=10)Tab.2 Comparison of each group ofmice HW/BW change(n=10)

    2.3 血清生化指標(biāo) 血清CK、LDH和GOT活性變化:阿霉素模型對照組小鼠血清CK、LDH和GOT活力均高于正常對照組,2組比較均有非常統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。葛花各劑量組CK、LDH和GOT活力較阿霉素模型對照組降低,2組比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05,P<0.01)。Vit E組對CK、LDH和GOT活力有抑制作用,和阿霉素模型對照組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05,P<0.01)。

    表3 各組小鼠血清CK、LDH和GOT活性變化比較(n=10)Tab.3 The comparison of serum CK,LDH and GOT activeness change(n=10)

    2.4 心肌生化指標(biāo) 心肌SOD活性、MDA含量和血清iNOS活性變化:與正常對照組比較,阿霉素模型對照組心肌組織SOD活性下降,心肌MDA含量和血清iNOS活力增加,2組比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。葛花各劑量組和Vit E組小鼠心肌MDA含量下降,SOD活力升高,與阿霉素模型對照組比較,差異有顯著性(P<0.05,P<0.01);葛花中、高劑量組還能使血清iNOS活力下降,與阿霉素模型對照組比較差異有顯著性(P<0.05)。

    表4 各組小鼠心肌SOD活性、MDA含量和血清iNOS活性變化比較(n=10)Tab.4 The comparison ofmicemyocardial SOD activity,MDA content and serum iNOS activity in each group(n=10)

    2.5 心肌形態(tài)學(xué)指標(biāo) 光鏡下觀察,如圖1所示:正常對照組:心肌組織結(jié)構(gòu)層次清晰,細(xì)胞間隙正常,無水腫,無心肌纖維破壞,細(xì)胞質(zhì)豐富均勻,胞膜完整,核清晰可見;阿霉素模型對照組:心肌細(xì)胞空泡變,大片壞死,肌纖維斷裂;葛花小劑量組:大片壞死,肌纖維斷裂,炎性細(xì)胞浸潤;葛花中劑量組:心肌細(xì)胞病理改變輕微;葛花高劑量組:心肌細(xì)胞未見病理改變;Vit E組:心肌細(xì)胞未見病理改變。

    圖1 各組小鼠心肌組織結(jié)構(gòu)變化(HE,×400)Fig.1 Groups ofmicemyocardial tissue structure change(HE,×400)

    2.6 心肌細(xì)胞凋亡陽性率及心肌細(xì)胞Bcl-2和Bax基因蛋白表達(dá) 如表5阿霉素模型對照組凋亡心肌細(xì)胞較多,為棕褐色深淺不一的凋亡小體,與正常對照組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。葛花高劑量組和Vit E組棕褐色凋亡細(xì)胞明顯減少,與阿霉素模型對照組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05,P<0.01)。

    阿霉素模型對照組Bcl-2和Bax基因蛋白表達(dá)較正常對照組明顯增加,2組比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。葛花各劑量組和Vit E組Bax基因蛋白表達(dá)較阿霉素模型對照組顯著下降(P<0.01,P<0.05),而Bcl-2基因蛋白的表達(dá)與阿霉素模型對照組無統(tǒng)計學(xué)差異,但是Bcl-2/Bax比值高于阿霉素模型對照組。

    表5 各組小鼠心肌細(xì)胞凋亡陽性率及心肌細(xì)胞Bcl-2和Bax基因蛋白表達(dá)比較(n=10)Tab.5 Groups ofmicemyocardial apoptosis positive rate and themyocardial cells the Bcl-2 and Bax genes protein expression is(n=10)

    3 結(jié)論

    以阿霉素(多柔比星)、表阿霉素(表柔比星)和吡喃阿霉素(吡柔比星)為代表的蒽環(huán)類抗癌藥(ATC),是近40年來被廣泛應(yīng)用的抗腫瘤藥物,其抗腫瘤譜較廣,抗癌作用強,化療指數(shù)較高,對造血系統(tǒng)腫瘤和實體腫瘤具有高效作用,對于在年輕人群中發(fā)病率高而且有望治愈的腫瘤,如急性白血病、霍奇金淋巴瘤以及乳腺癌等更具有不可替代的作用[8-13]。在本實驗中,通過對模型對照組小鼠經(jīng)口灌胃(ig)阿霉素3 mg/kg(隔天1次,共7次)。實驗結(jié)束后,和正常對照組比較,阿霉素模型對照組HW/ BW明顯降低,血清CK、LDH、GOT和iNOS活力均增高,心肌組織SOD活性下降、MDA含量增加,2組比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05,P<0.01);鏡下觀察,阿霉素模型對照組心肌損傷明顯,心肌細(xì)胞排列紊亂,心肌細(xì)胞部分呈現(xiàn)水腫和空泡變性,部分呈現(xiàn)灶狀或片狀壞死,肌間隙變寬,部分肌纖維溶解、心肌纖維斷裂,心肌細(xì)胞間有中性粒細(xì)胞及單核、淋巴細(xì)胞浸潤。說明本實驗阿霉素所致小鼠中毒性心肌炎造模成功。

    阿霉素模型對照組Bcl-2和Bax基因蛋白表達(dá)較正常對照組明顯增加,2組比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。葛花各劑量組和Vit E組Bax基因蛋白表達(dá)較阿霉素模型對照組顯著下降(P<0.01,P<0.05),而Bcl-2基因蛋白的表達(dá)與阿霉素模型對照組無統(tǒng)計學(xué)差異,但是Bcl-2/Bax比值高于阿霉素模型對照組。表明阿霉素可導(dǎo)致小鼠心肌Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)明顯增加,且Bcl-2/Bax比值最小,促凋亡基因Bax蛋白占主導(dǎo)地位,使小鼠心肌細(xì)胞凋亡增加;葛花總黃酮能使促凋亡基因Bax蛋白的表達(dá)明顯降低,同時葛花總黃酮和Vit E對阿霉素所誘發(fā)的抑制凋亡基因Bcl-2蛋白的表達(dá)增加無拮抗作用。

    在本實驗中阿霉素抑制了SOD的活性,使得本來含有較少的SOD等酶的心肌組織,抗自由基酶進(jìn)一步耗盡,從而使自由基大量產(chǎn)生、蓄積,心肌不可避免受到損傷,脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物MDA的含量亦增多;葛花總黃酮可以增強SOD活性,抑制MDA含量的升高,減少LDH的漏出,并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性,同時具有抗脂質(zhì)過氧化作用,使之具有保護(hù)阿霉素中毒心肌細(xì)胞的功效??怪|(zhì)過氧化可能是葛花保護(hù)阿霉素心肌細(xì)胞毒性機制之一,但這種保護(hù)作用的確切機制有待于進(jìn)一步探討。

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    (編校:譚玲)

    Protective effect of flos puerariae flavonoid on adriam ycin-induced toxic m yocarditis

    XU Qing-guo1,TAN Jin-qiang2,SONG Xi-lin3,CHEN Yuan4

    (1.Department of Cardiology,Shandong Provincal Traffic Hospital,Jinan 250031,China;2 Department of Cardiology,People's Hospital of Jiyang County,Jiyang 251400,China;3.Department of Gastrointestinal Surgery,Tumor Hospital of Shandong Province,Ji'nan 250012,
    China;4.Department of Cardiology,The Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical University,Chongqing 400010,China)

    ObjectiveTo investigate the protective effect of flos puerariae flavonoid on adriamycin(ADR)-induced toxic myocarditis and its mechanisms from morphological,biochemical and molecular levels.Methods96 healthy Kunming male mice were random ly divided into 6 groups:normal control group,ADRmodel control group,ADR+low dose of flos puerariae flavonoid group(50mg/kg),ADR+middle dose of flos puerariae flavonoid group(100mg/kg),ADR+high dose of flos puerariae flavonoid group(200mg/kg),and Vit E positive control group(40mg/kg),16 in each group.The drugswere orally administered for consecutive 15 d and themodelof toxicmyocarditiswas induced by intraperitoneal injection of ADR(3mg/ kg)in mice from day 2,one time every other day,for 7 times Colorimetry was used tomeasure the changes ofmarker enzymes aboutmyocardial injury and inducible nitric oxide synthase(iNOS)activity in serum and tissue;immunohistochemicalmethod was adopted to detecte the expression ofmyocardial apoptosis related proteins Bax and bcl-2;HE staining was conducted to observe the pathological changes of cardiac structure.ResultsCompared with normal control group,ADR(3 mg/kg,ip,7 times)induced the elevation of serum creatine kinase(CK),lactate dehydrogenase(LDH),aspartate transaminase(GOT)and iNOS activity increased significantly in mice(P<0.01).Meanwhilemyocardial superoxide dismutase(SOD)activity decreased,and themalondialdehyde(MDA)content increased(P<0.01).Myocardial cell apoptosis inmice increased significantly,and the apoptosis rate was(40.5±5.2)%;the expressions of Bax and Bcl-2 were significantly increased(P<0.01),However,the Bcl-2/Bax ratio decreased.The flos puerariae flavonoid(50,100,200mg/kg,ig,15 d)and Vit E positive control group could reverse the changes induced by ADR,decrease serum CK,LDH,GOT and iNOS activities,increased myocardial SOD activity,lower MDA content and the expression of bax protein,and elevated Bcl-2/Bax ratio,in a dosedependentmanner.Lightmicroscopy confirmed that flos puerariae flavonoid significantly alleviated the changes ofmyocardialmicrostructure.ConclusionADR could inducemyocardial cell apoptosis and lead toxic myocarditis in experimentalmice.The flos puerariae flavonoid has protective effect on ADR-induced myocardial injury and themechanism may be related to elevatingmyocardial SOD activity and anti-lipid peroxidation,inhibiting the expression of Bax protein and adriamycin-induced cardiomyocyte apoptosis.

    flos puerariae flavonoid;adriamycin;myocardial lipid peroxidation;apoptosis;Bax;Bcl-2

    R285

    A

    1005-1678(2014)07-0027-04

    國家自然科學(xué)基金(C030306)

    徐慶國,男,本科,副主任醫(yī)師,研究方向:冠心病介入,E-mail:qch1821460091@163.com。

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