巨大兒胎盤組織中HO- 1、IGF- 1的變化及其意義

李真真，魏碧蓉，薛海燕，婁偉

(莆田學(xué)院醫(yī)學(xué)院，福建 莆田 351100)

巨大兒是指出生體重≥4 000 g的活產(chǎn)新生兒[1]。妊娠糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)是巨大兒最常見的原因。巨大兒的具體發(fā)生機(jī)制尚不明確，近年來，多種調(diào)控胎兒生長過度的細(xì)胞因子被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)和證實。血紅素氧合酶- 1(heme oxygenase- 1，HO- 1)亦稱熱休克蛋白32(heat shock protein，HSP32)，廣泛分布于胎盤絨毛組織中，在多種因素刺激下能保護(hù)胎盤組織細(xì)胞，增加子宮胎盤的血流灌注，以保證胎兒在宮內(nèi)有足夠的營養(yǎng)供應(yīng)。研究[2]證實，胰島素樣生長因子- 1(insulin- like growth factor- 1，IGF- 1)與胎兒及生后早期的促生長相關(guān)，是導(dǎo)致巨大兒的重要物質(zhì)之一。HO- 1與IGF- 1在胎盤組織均有表達(dá)[3- 4]，推測胎盤中兩者的表達(dá)狀態(tài)及其水平與巨大兒的發(fā)生有關(guān)。本研究通過觀察巨大兒胎盤組織中HO- 1、IGF- 1的改變情況，探討HO- 1與IGF- 1的相互關(guān)系，為深入了解它們在巨大兒發(fā)生中的作用提供依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

隨機(jī)選擇我院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科2012年5月至9月出生的新生兒60例，其中12例確診為GDM[5]母親分娩的巨大兒(巨大兒A組)，18例為健康孕婦分娩的巨大兒(巨大兒B組)，新生兒出生體重均≥4 000 g；將30例健康孕婦同期分娩的正常出生體重(2 500～4 000 g)新生兒作為對照組。3組研究對象均為足月單胎，胎齡37～42周，無宮內(nèi)感染、窒息史及先天畸形，系自然分娩或剖宮產(chǎn)(均因胎位、社會因素或符合巨大兒剖宮產(chǎn)指征)。所有產(chǎn)婦無高血壓、心臟病、肝病等疾??；無胎盤、臍帶等異常。

巨大兒A組中男7例(58.33%)，女5例(41.67%)；自然分娩2例(16.67%)，剖宮產(chǎn)10例(83.33%)；平均出生體重為(4 412.50±303.86) g。巨大兒B組中男6例(33.33%)，女12例(66.67%)；自然分娩7例(38.89%)，剖宮產(chǎn)11例(61.11%)；平均出生體重為(4 109.44±94.90) g。對照組中男11例(36.67%)，女19例(63.33%)；自然分娩25例(83.33%)，剖宮產(chǎn)5例(16.67%)；平均出生體重(3 386.67±127.94) g。3組產(chǎn)婦的年齡、孕周有可比性。

1.2 研究方法

1.2.1 胎盤組織的采集

胎兒及胎盤娩出后立即檢查臍帶及胎盤有無異常，無菌操作下于胎盤中間帶取1 cm×1 cm×1 cm大小的組織：包括絨毛膜板胎盤的全厚度胎盤組織，用無菌生理鹽水漂洗后吸干水分，一部分固定于10%的甲醛溶液，用于免疫組化的測定；另一部分立即存放在-80 ℃超低溫冰箱中，用于ELISA檢測。同時由專人精確測量新生兒體重、胎盤重量等，所有研究對象標(biāo)本的采集均經(jīng)產(chǎn)婦知情同意。

1.2.2 檢測方法

山羊多克隆HO- 1抗體(SC- 1796)購自美國Santa Cruz公司，SP試劑盒、DAB顯色劑購自上海生工公司，人IGF- 1定量酶聯(lián)免疫試劑盒、人HO- 1酶聯(lián)免疫試劑盒購自美國DSL公司。

1.2.2.1 免疫組織化學(xué)檢測 胎盤標(biāo)本用10%甲醛固定24 h以上，經(jīng)石蠟包埋切片，分別行常規(guī)HE染色及HO- 1、IGF- 1免疫組織化學(xué)染色。再于光鏡下觀察HO- 1及IGF- 1的分布及表達(dá)，以細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞，每張切片隨機(jī)采集5個視野，參照Karan等[6]的細(xì)胞染色強(qiáng)度結(jié)合陽性細(xì)胞百分比法評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷。細(xì)胞染色強(qiáng)度以胞漿或胞核出現(xiàn)深棕色顆粒為強(qiáng)陽性記3分，出現(xiàn)淡黃色顆粒為弱陽性記1分，介于兩者之間者為中度陽性記2分；記錄陽性染色細(xì)胞百分?jǐn)?shù)，陽性細(xì)胞數(shù)≥76%為4分，51%～75%為3分，26%～50%為2分，6%～25%為1分，≤5%為0分。染色強(qiáng)度記分與陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)記分乘積為每個視野得分，每個視野平均值為最后免疫組化積分。

1.2.2.2 ELISA檢測 采用雙抗體夾心ELISA法。從-80 ℃超低溫冰箱中取出胎盤組織標(biāo)本，研磨、超聲波粉碎制成勻漿，離心取上清液。在96孔板上分別包被HO- 1抗體或IGF- 1抗體0.1 ml(含抗體0.1 μg)，4 ℃過夜。洗滌后分別加入1∶2～1 000倍比稀釋的組織上清液，同時設(shè)立空白對照、陰性對照及陽性對照孔，37 ℃孵育1 h。洗滌后分別加入HO- 1抗體或IGF- 1抗體0.1 ml(含抗體0.1 μg)，37 ℃孵育1 h，洗滌后加入TMB底物顯色。孵育后終止反應(yīng)，在ELISA檢測儀上測各孔濃度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 胎盤組織HO- 1、IGF- 1表達(dá)比較

見圖1、2。

1.巨大兒A組； 2.巨大兒B組； 3.對照組

圖1胎盤HO- 1的表達(dá)免疫組化染色×400

Fig1Expressionofhemeoxygenase- 1intheplacentasofmacrosomiagroupA(1)，macrosomiagroupB(2)andcontrolgroup(3)

1.巨大兒A組； 2.巨大兒B組； 3.對照組

圖2胎盤IGF- 1的表達(dá)免疫組化染色×400

Fig2Expressionofinsulin-likegrowthfactor- 1intheplacentasofmacrosomiagroupA(1)，macrosomiagroupB(2)andcontrolgroup(3)

3組HO- 1、IGF- 1均有不同程度的表達(dá)，HO- 1主要定位于胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞及絨毛間質(zhì)細(xì)胞的胞漿中，血管內(nèi)皮細(xì)胞有少量表達(dá)；IGF- 1主要定位于滋養(yǎng)層上皮細(xì)胞及部分血管內(nèi)皮細(xì)胞，以細(xì)胞膜、細(xì)胞漿為主。經(jīng)方差分析,3組胎盤組織中HO- 1、IGF- 1表達(dá)有明顯差異(均P<0.05)，兩兩比較結(jié)果提示，巨大兒A組及B組HO- 1、IGF- 1表達(dá)均明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。而巨大兒A組與B組HO- 1、IGF- 1比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。3組胎盤組織HO- 1、IGF- 1免疫組化積分比較見表1。

組 別nHO-1積分IGF-1積分巨大兒A組1213.33±4.7212.27±1.61巨大兒B組1811.72±2.9511.89±2.07對照組306.98±3.668.95±3.69F值0.9780.816P值0.0240.043

2.2 胎盤組織中HO- 1、IGF- 1水平比較

胎盤HO- 1、IGF- 1定量分析結(jié)果見表2。

Tab 2 Comparison of the enzyme linked immunosorbent assay in the placentas of heme oxygenase- 1，insulin- 1ike growth factor- 1 between the three ng·ml-1

3組新生兒HO- 1、IGF- 1水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，進(jìn)一步多重比較顯示，巨大兒A組和B組HO- 1水平較對照組均明顯增高(MD=0.056，P<0.05；MD=0.045，P<0.05)，巨大兒A組與B組胎盤HO- 1水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(MD=0.010，P>0.05)。巨大兒A組和B組中IGF- 1水平較對照組均明顯增高(MD=0.033，P<0.05；MD=0.027，P<0.05)，巨大兒A組與B組胎盤IGF- 1水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(MD=0.006，P>0.05)。

2.3 胎盤HO- 1與IGF- 1水平的相關(guān)性分析

對3組胎盤中HO- 1與IGF- 1水平進(jìn)行Pearson相關(guān)分析，對照組HO- 1與IGF- 1水平無相關(guān)性(r=0.284，P=0.095)，巨大兒A組、B組HO- 1和IGF- 1的水平呈正相關(guān)(r=0.895，P=0.000；r=0.878，P=0.000)。

3 討 論

血紅素氧合酶(heme oxygenase，HO)是催化血紅素氧化分解為膽紅素、一氧化碳(CO)、Fe2+的起始酶和限速酶，在體內(nèi)有HO- 1、HO- 2、HO- 33 3種同工酶[7]。其中HO- 1亦稱熱休克蛋白32(HSP32)，分子量約為32 000。人的HO- 1染色體定位于22q12，誘導(dǎo)性表達(dá)于機(jī)體各組織細(xì)胞的微粒體內(nèi)，血管平滑肌和子宮平滑肌中均有表達(dá)[8]。誘導(dǎo)因素包括血紅素、缺氧、金屬離子、細(xì)胞因子以及激素如胰島素、地塞米松等。現(xiàn)有資料表明，胎盤組織富含HO- 1。Yoshiki等[9]發(fā)現(xiàn)，在足月妊娠胎盤HO- 1主要表達(dá)于絨毛合體滋養(yǎng)細(xì)胞，其次分布于絨毛間質(zhì)細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞。由于胎盤絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞分別與母血、胎血中高濃度血紅蛋白接觸，血紅蛋白和游離血紅素均可發(fā)生自動氧化而產(chǎn)生超氧化物和其他自由基，而HO一方面能清除血紅素及其產(chǎn)生的有害物質(zhì)，另一方面催化生成很強(qiáng)的抗氧化劑，對胎盤和胎兒組織細(xì)胞具有保護(hù)作用。本研究用免疫組化方法檢測亦顯示，HO- 1高水平表達(dá)于胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞及絨毛間質(zhì)細(xì)胞，除了使母體中的營養(yǎng)物質(zhì)能更好地通過滋養(yǎng)細(xì)胞運至臍靜脈外，還可能與胎盤血管發(fā)育有關(guān)，從而維持血管的正常分化發(fā)育以及充足的胎盤灌注來保證胎兒健康發(fā)育。有研究[4]表明，胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩(intrauterine growth retardation，IUGR)的產(chǎn)婦胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞HO- 1表達(dá)降低，分解血紅素產(chǎn)生內(nèi)源性CO減少，使胎盤血管收縮，胎兒微血管阻力增加，影響胎盤供血，導(dǎo)致胎兒生長受限。本研究顯示，不管是GDM母親分娩的巨大兒還是健康母親分娩的巨大兒，胎盤HO- 1的表達(dá)均明顯高于正常出生體重新生兒。ELISA檢測HO- 1水平也得到類似結(jié)果?？赡苁蔷薮髢涸趯m內(nèi)相對缺氧導(dǎo)致胎兒紅細(xì)胞生成較多，微血管阻力增加，誘導(dǎo)HO- 1表達(dá)增加；HO- 1通過促進(jìn)CO的生成起到舒張血管的作用，有利于胎兒從母體及胎盤獲取充足的營養(yǎng)，促進(jìn)胎兒發(fā)育，最終表現(xiàn)為胎兒生長過度。而巨大兒中有相當(dāng)一部分母親患妊娠期糖尿病，處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞受到母血中高血糖、高胰島素等刺激，使宮內(nèi)慢性缺氧環(huán)境加劇。在對自發(fā)性糖尿病大鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，HO/CO系統(tǒng)對胰島細(xì)胞及慢性高血糖誘發(fā)的氧化性損傷具有保護(hù)作用[10]。因此，GDM母親分娩的巨大兒胎盤HO- 1表達(dá)也增加，同時生成膽紅素、CO增多，從而增強(qiáng)胎兒抗氧化損傷的能力。

有研究表明，胰島素是真正的胎兒生長激素，具有IGF- 1受體介導(dǎo)的促進(jìn)生長的作用[11]。在無糖尿病的產(chǎn)婦中，IGF- 1是導(dǎo)致巨大兒的重要物質(zhì)。Lauszus等[12]也發(fā)現(xiàn)，糖尿病孕婦外周血IGF- 1水平與新生兒出生體重呈正相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，在巨大兒胎盤組織中IGF- 1表達(dá)強(qiáng)度高，胎盤IGF- 1水平明顯高于對照組(P<0.05)，均提示胎盤IGF- 1水平增加可能與巨大兒形成密切相關(guān)。母體過多的營養(yǎng)物質(zhì)通過胎盤到達(dá)胎兒體內(nèi)，刺激胎兒B細(xì)胞分泌胰島素量增加，導(dǎo)致高胰島素血癥，同時高血糖可能激活了血糖- 胰島素- 胰島素樣生長因子軸，胰島素和IGF- 1的增多共同導(dǎo)致巨大兒的產(chǎn)生[13]。

另外，GDM母親分娩巨大兒胎盤組織中HO- 1與IGF- 1表達(dá)高于健康母親分娩巨大兒的，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。這可能與病例數(shù)過少有關(guān)。HO- 1與IGF- 1是否與其他原因所致巨大兒的發(fā)生有關(guān)，有待進(jìn)一步探討。

Kreiser等[14]發(fā)現(xiàn)，妊娠大鼠被轉(zhuǎn)染HO- 1基因后，所分娩的鼠仔的平均體重明顯增加，并且隨著轉(zhuǎn)染組HO- 1表達(dá)的增高，胎盤中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白- 1(IGFBP- 1)及其受體的表達(dá)也相應(yīng)增加，說明HO- 1及其代謝產(chǎn)物不僅能直接增加胎盤血流灌注，還能通過信號傳導(dǎo)系統(tǒng)增加胎盤相關(guān)生長因子的表達(dá)，進(jìn)一步改善胎盤循環(huán)，促進(jìn)胎兒發(fā)育。本研究也初步探討了胎盤中HO- 1水平與IGF- 1水平的相關(guān)性，結(jié)果顯示兩者呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。提示HO- 1水平增高可能通過IGFBP- 1途徑，使IGF- 1水平升高，從而參與巨大兒的發(fā)生，胎盤HO- 1與IGF- 1在胎兒生長發(fā)育過程中發(fā)揮了重要作用。

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