戊型肝炎病毒ORF2截短蛋白p154在畢赤酵母中的分泌性表達及其抗原性

徐明杰，張建華，孟繼鴻

(東南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210009)

戊型肝炎(hepatitis E，HE)是由戊型肝炎病毒(hepatitis E virus，HEV)感染引起的常見的消化道傳染病。HEV基因組全長約7.2kb，含有3個開放讀碼框架(ORFs)：ORFl、ORF2、ORF3[1]。由ORF2編碼的pORF2是一個含有660個氨基酸的糖基化蛋白，分子質(zhì)量約72kDa，其近羧基末端的區(qū)域含有HEV主要的抗原決定簇，是HEV特異性中和性抗原表位的所在區(qū)域，可以采用基因工程技術(shù)在原核或真核表達系統(tǒng)中表達 ORF2編碼蛋白研發(fā)重組戊型肝炎疫苗[2- 5]。

酵母表達系統(tǒng)是基因工程研究中最常用的表達系統(tǒng)之一，但目前國內(nèi)外尚未見應(yīng)用畢赤酵母表達系統(tǒng)分泌性表達HEV結(jié)構(gòu)蛋白進行疫苗研發(fā)的報道。為了探討戊型肝炎基因工程疫苗生產(chǎn)的新途徑，我們利用畢赤酵母表達系統(tǒng)進行了戊型肝炎病毒的截短結(jié)構(gòu)蛋白表達的初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒和菌株 大腸桿菌DH5α為東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院基因診斷與疫苗研發(fā)實驗室保存。Pichiapastoris菌株GS115、酵母表達載體pPICZαA購自Invitrogen公司。

1.1.2 工具酶和試劑EcoRⅠ、NotⅠ酶購于美國Fermentas 公司；高保真酶購于美國Roche 公司；SacⅠ、T4DNA Ligase 購于大連寶生物工程有限公司；Zeocin購于美國Invitrogen公司；甲醇購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司；酵母抽提物、胰蛋白胨購于英國COXOID公司；HRP- 羊抗小鼠IgG、HRP- 羊抗兔IgG購于美國KPL公司。

1.1.3 引物設(shè)計與合成 利用DNASTAR軟件系統(tǒng)中的MegAlign Program模塊對GenBank中已知的各基因型HEV代表株進行計算機輔助序列分析，在不同基因型HEV保守區(qū)合成的一組通用性引物，位于HEV ORF2 區(qū)域，能有效地擴增1、2、3、4型HEV的基因片段。JM2：5′- CCGACAGAATTGATTTCGTCG GC- 3′；JM3：5′- TYGTCTCRGCCAATGGCGAGC- 3′；JM35：5′- CGRCAYTCMGGGCARAARTCATC- 3′；JM36：5′- CATYTTAAGRCGCTGMAGCTCAGC- 3′。引物由美國疾病控制和預(yù)防中心(CDC)合成，工作濃度10pmol·μl-1。

利用Primer 5.0分別設(shè)計上下游寡核苷酸引物，在分泌表達載體pPICZαA上游引物的5′端和下游引物的3′端分別引入酶切位點EcoRⅠ和NotⅠ。上游引物5′- TTTGAATTCATGCCTACCCCCTCGCCTG- 3′，下游引物5′- TTTGCGGCCGCTCAAGAATGAGGTGC- 3′，引物由Invitrogen 上海貿(mào)易有限公司合成，工作濃度為10 pmol·μl-1。

1.2 方法

1.2.1 標本采集及病毒RNA提取與RT- PCR鑒定 采集南京市第二醫(yī)院住院戊型肝炎患者糞便標本進行RT- PCR檢測和測序鑒定，并依此為模板擴增ORF2 p154基因。QIAamp 病毒RNA抽提試劑盒(QIAGEN)提取病毒RNA。采用一步法RT- PCR試劑盒(QIAGEN)進行擴增，一步法RT- PCR的反應(yīng)體系為20μl，包括引物JM2、JM36各0.5μl，One Step RT- PCR 緩沖液4μl，dNTP 0.8μl，一步法酶混合液0.8μl，RNA 10μl，用DEPC水補足至20μl。一步法RT- PCR的擴增條件為：50℃逆轉(zhuǎn)錄45min；95℃預(yù)變性15min；94℃變性30s，50℃退火30s，72℃復(fù)性延伸80s，50個循環(huán)；72℃延伸8min。第2輪PCR反應(yīng)體系為25μl，包括引物JM3和JM35各0.5μl、10倍PCR緩沖液2.5μl、dNTP混合液0.5μl、高保真DNA聚合酶0.5μl、第1輪PCR產(chǎn)物 2μl，用DEPC水補足至25μl。第2輪PCR的擴增條件為：94 ℃預(yù)變性2min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃復(fù)性延伸80s，35個循環(huán)；72℃延伸8min。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳分析。切膠回收DNA后送 Invitrogen公司上海分公司完成測序。

1.2.2 標本的基因序列分析和構(gòu)建系統(tǒng)進化樹利用生物信息學(xué)軟件DNAStar Lasergene 7.0 對正、反向核苷酸序列進行整理和比對。從GenBank下載基因1至4 型毒株序列，用MEGA 5.0軟件包進行多序列比對以及構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。為了評估進化樹繪制的可靠性，采用一株禽HEV(GenBank 號：AY535004)作為對照。

1.2.3 PCR擴增HEV ORF2p154 (aa 452～605)基因 PCR的反應(yīng)體系為25μl，包括上、下游引物各1.0μl，高保真DNA 聚合酶0.5μl，高保真酶緩沖液2.5μl，dNTP 1.0μl，HEV RNA 1.0μl，用DEPC水補足至25μl。PCR的擴增條件為：94℃預(yù)變性2min；94℃變性30s，54℃退火30s，72℃復(fù)性延伸1min，35個循環(huán)；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳分析。Qiagen膠回收試劑盒回收。

1.2.4 pPICZαA/p154重組表達載體的構(gòu)建 用EcoRⅠ/NotⅠ雙酶切酵母表達載體pPICZαA和 PCR片段， 雙酶切后的產(chǎn)物經(jīng)Qiagen膠回收試劑盒回收。T4DNA 連接酶將雙酶切后的載體pPICZαA和 PCR片段相連，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α。將能在LB (25μg·ml-1Zeocin+) 平板上生長的單菌落進行菌落PCR 鑒定，并送Invitrogen公司上海分公司測序。將測序正確的陽性菌落進行搖菌培養(yǎng)后用Biomiga公司的EZ geneTM抽提試劑盒抽提質(zhì)粒。

1.2.5 電轉(zhuǎn)化及陽性克隆篩選 將上述重組表達質(zhì)粒用SacⅠ進行單酶切，后電轉(zhuǎn)化入酵母細胞GS115。并用100、500、1000、2000μg·ml-1Zeocin+的YPDS平板進行含高拷貝質(zhì)粒酵母菌的篩選。將能在YPDS (μg·ml-1Zeocin+) 平板上生長的單菌落進行菌落PCR 鑒定。

1.2.6 誘導(dǎo)表達 篩選具有高Zeocin抗性且菌落PCR陽性的菌株作為表達株。接種單克隆至4ml YPD培養(yǎng)基中于30℃，260r·min-1搖菌培養(yǎng)至OD600=1。取3 ml菌液轉(zhuǎn)種到50ml BMGY培養(yǎng)基，30℃、260r·min-1搖菌至OD600=15～20。室溫、1500×g、5min離心收集菌體，用無菌雙蒸水洗滌菌體，離心后重懸于10ml的BMMY，30℃、260r·min-1加甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)，連續(xù)誘導(dǎo)120h，期間每隔12h補加甲醇于培養(yǎng)基中至終濃度為0.5%，每24h取樣1ml，4℃、13000 r·min-1離心20min。將上清于-80℃冰箱保存，留待檢測。

1.2.7 表達產(chǎn)物的檢測 SDS- PAGE檢測：配制12%分離膠、5%濃縮膠，樣品經(jīng)煮沸5min后上樣，考馬斯藍染色。蛋白質(zhì)印跡法鑒定：SDS- PAGE電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)移至NC膜，以0.25mA恒流轉(zhuǎn)移90min后，5%牛奶TBST室溫封閉1h。加入一抗(HEV感染兔恢復(fù)期血清，HEV單克隆抗體6F9，均為1︰200稀釋)，4℃過夜。TBST洗滌后加入二抗(為HRP- 羊抗兔IgG與HRP- 羊抗小鼠IgG，均為1︰2000稀釋)，室溫孵育2h。DAB顯色，待膜上出現(xiàn)清晰的棕色條帶后，立即以蒸餾水沖洗終止反應(yīng)。

2 結(jié) 果

2.1 HEV毒株的基因擴增和序列分析

將本次采集的南京市第二醫(yī)院住院戊型肝炎患者糞便標本命名為JS1533，用套式PCR獲得HEV ORF2 691bp片段，經(jīng)測序后與已知基因1～4型毒株進行核苷酸同源性比對，并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。JS1533與已知基因1、2、3、4型HEV的核苷酸同源性為76.06%～78.87%、75.45%、78.07%～80.89%、82.94%～90.54%。系統(tǒng)進化(圖1)分析顯示，JS1533與基因4型處于同一分支，說明JS1533為基因4型。將序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，GenBank登錄號為JX847414。

2.2 外源基因整合到酵母細胞基因組的鑒定

純化后的線性重組載體電轉(zhuǎn)化入畢赤酵母細胞GS115，并用遞增的Zeocin濃度篩選高拷貝的重組菌。最終選擇在2000μg·ml-1Zeocin 的YPDS平板上生長的單菌落，用pPICZαA上的引物進行菌落PCR 鑒定，篩選陽性克隆。轉(zhuǎn)化菌可擴增出729bp的目的條帶，與預(yù)期大小一致。

2.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達

將菌落PCR陽性的重組菌在培養(yǎng)基中經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)后進行甲醇誘導(dǎo)表達[6]，每24h取樣，連續(xù)誘導(dǎo)120h。SDS- PAGE分析顯示,重組菌能將目的蛋白分泌至上清中，目的蛋白在誘導(dǎo)后72 h表達量達到高峰，見圖2。將菌株命名為GS115/p154。p154的分子質(zhì)量為22 kDa，分子質(zhì)量大小比預(yù)期的17 kDa要大，原因可能為p154的N562在Asn- 562發(fā)生糖基化，修飾的糖鏈使蛋白分子質(zhì)量增加。與BSA定量比較后顯示，目的蛋白在誘導(dǎo)后72 h時上清中的表達量可達到200μg·ml-1。

2.4 蛋白質(zhì)印跡法分析重組蛋白的抗原性

用HEVHEV感染兔恢復(fù)期血清及HEV單克隆抗體6F9與目的蛋白進行蛋白質(zhì)印跡反應(yīng)，結(jié)果顯示p154均在與SDS- PAGE一致的位置出現(xiàn)特異性反應(yīng)條帶，無非特異性反應(yīng)，見圖3。表明目的蛋白具有良好的抗原性。

3 討 論

我國的HE以流行和散發(fā)兩種形式存在[7]，列入我國法定報告的乙類傳染病進行管理。由于缺少穩(wěn)定可靠的HEV體外培養(yǎng)系統(tǒng)，HEV滅活或減毒疫苗的研發(fā)受到限制，因此HE疫苗研究主要采用基因工程重組蛋白。至今多種pORF2重組蛋白已在大腸桿菌和昆蟲表達系統(tǒng)中獲得成功[2- 5]，但是pORF2在大腸桿菌原核細胞表達時常以包涵體形式存在，蛋白質(zhì)很難正確折疊，無法形成和保持天然的空間構(gòu)象；昆蟲表達系統(tǒng)缺點是要用血清培養(yǎng)，成本比較高，且昆蟲蛋白本身的異源性也成為其作為疫苗研發(fā)的一個弊端。本研究的創(chuàng)新點在于選擇了新的表達系統(tǒng)畢赤酵母表達系統(tǒng)，酵母屬于低等真核微生物，當(dāng)前對酵母特性和遺傳背景的研究較清楚：(1) 基因重組易操作；(2) 易于在營養(yǎng)成份簡單的培養(yǎng)基中高密度發(fā)酵培養(yǎng)，適于工業(yè)化生產(chǎn)；(3) 具有分泌型表達模式，能正確折疊和修飾；(4) 發(fā)酵液中雜蛋白少，產(chǎn)物易于純化；(5) 無熱原和其它病原體，且不含癌基因，表達產(chǎn)物的安全性高。目前全世界大規(guī)模生產(chǎn)和使用的乙型肝炎疫苗也是由酵母表達系統(tǒng)的產(chǎn)物制成。因此如何利用酵母表達系統(tǒng)生產(chǎn)高表達、低成本的戊型肝炎基因工程疫苗對我國戊型肝炎流行的控制十分重要。

圖1基于JS1533與基因1、2、3、4型HEV、禽HEVORF2部分核苷酸序列(nt6348-7038，691bp)構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹

Fig1PhylogenetictreebasedonpartialnucleotidesequencesofHEVORF2ofJS1533，genotype1，2，3，4andavianHEVstrains

1. 蛋白分子質(zhì)量標記；2～7.pPICZaA/p154- GS115培養(yǎng)上清，依次誘導(dǎo)表達0、24、48、72、96、120 h；8. pPICZαA- GS115對照菌培養(yǎng)上清， 誘導(dǎo)表達72 h；9～13.BSA濃度依次為1000、500、250、125、62.5 μg·ml-1

圖2HEV重組菌表達產(chǎn)物SDS-PAGE電泳分析

Fig2SDS-PAGEanalysisofp154inthesupernatant

2000年Schofield 等[8]利用噬菌體展示技術(shù)將2個中和性單抗的表位定位在HEV ORF2 編碼蛋白的第578～607位氨基酸之間，認為HEV中和抗原表位是一個線性表位。幾乎同時我們[9]將HEV 的中和抗原表位定位在HEV ORF2 編碼蛋白的452～617 位氨基酸，確認HEV中和抗原表位是構(gòu)型依賴性表位，不是線性表位。這一研究結(jié)果得到了美國國立衛(wèi)生研究院 Zhou等[10]的證實，他們將中和性抗原表位的定位縮短至458～607位氨基酸。但作者所在實驗室張紅梅等[11]發(fā)現(xiàn)，HEV中和性抗原表位可繼續(xù)縮短至460～605位氨基酸，是目前文獻報道中含有HEV 中和抗原表位的最短ORF2 編碼蛋白片段，理論上含有該片段的pORF2蛋白均能誘導(dǎo)中和抗體，可以成為HE疫苗的候選品。廈門大學(xué)研究人員利用大腸桿菌以包涵體形式表達的HEV 1型ORF2蛋白片斷p239(aa368～606) 已完成疫苗三期臨床試驗并成功上市[4]。本研究中我們選擇了HEV ORF2編碼的p154(452～605aa，154個aa)，既包含中和抗原表位又比p239片段小，目的是期望得到分泌性表達的可溶性蛋白，保持它的天然構(gòu)象和活性。

1. 蛋白分子質(zhì)量標記；2. 誘導(dǎo)表達前；3. pPICZαA- GS115誘導(dǎo)表達72 h培養(yǎng)上清；4. pPICZαA/p154- GS115誘導(dǎo)表達72 h培養(yǎng)上清

圖3HEV重組蛋白p154與HEV感染兔恢復(fù)期血清和HEV單抗的蛋白質(zhì)印跡法分析

Fig3Westernblottinganalysisofp154reactedwiththerecoveryserumofrabbitinfectedbyHEVandmonoclonalantibody6F9

在本研究中我們利用基因重組技術(shù)成功構(gòu)建了含HEV p154片段的pPICZαA重組質(zhì)粒，并在畢赤酵母菌株GS115中實現(xiàn)了p154的分泌性表達。表達蛋白的分子質(zhì)量約為22 kDa，與預(yù)期結(jié)果相比偏大，原因可能與p154中存在的Asn- 562潛在糖基化位點發(fā)生糖基化修飾有關(guān)，增加的糖鏈使目的蛋白分子質(zhì)量變大。與已知濃度牛血清白蛋白定量分析相比，上清中目的蛋白的表達量可達到200μg·ml-1，如果使用發(fā)酵罐高密度培養(yǎng)，其表達量將有成倍提高。蛋白質(zhì)印跡法分析結(jié)果顯示，目的蛋白可與HEV感染兔恢復(fù)期血清及HEV單克隆抗體6F9進行反應(yīng)，表明目的蛋白具有良好的抗原性和特異性。HEV p154重組蛋白在畢赤酵母中的成功表達為如何利用酵母表達系統(tǒng)生產(chǎn)高表達、低成本的戊型肝炎基因工程疫苗提供了實驗基礎(chǔ)，有待進一步深入研究。

[1] TAM A W，SMITH M M，GUERRA M E，et al.Hepatitis E virus(HEV): molecular cloning and sequencing of the full- length viral genome[J].Virology，1991，185(1):120- 131．

[2] PURCELL R H，NGUYEN H，SHAPIRO M，et al.Pre- clinical immunogenicity and efficacy trial of a recombinant Hepatitis E vaccine[J].Vaccine，2003，21(19- 20):2607- 2615．

[3] SHRESTHA M P，SCOTT R M，JOSHI D M，et al.Safety and efficacy of a recombinant hepatitis E vaccine[J].N Engl J Med，2007，356(9):895- 903．

[4] ZHU F C，ZHANG J，ZHANG X F，et al.Efficacy and safety of a recombinant hepatitis E vaccine in healthy adults: a large- scale，randomised，double- blind placebo- controlled，phase 3 trial[J].Lancet，2010，376(9744):895- 902．

[5] 董晨，孟繼鴻.一種新型戊型肝炎病毒樣顆粒的表達、純化及其免疫原性[J].細胞與分子免疫學(xué)雜志，2006，22(3)：339- 342．

[6] BATRA G，GURRAMKONDA C，NEMANI S K，et al.Optimization of conditions for secretion of dengue virus type 2 envelope domain Ⅲ using Pichia pastoris[J].J Biosci Bioeng，2010，110(4):408- 414.

[7] AYE T T，UCHIDA T，MA X Z，et al.Complete nucleotide sequence of a hepatitis E virus isolated from the Xinjiang epidemic(1986- 1988) of China[J].Nucleic Acids Res，1992，20(13):3512．

[8] SCHOFIELD D J，GLAMANN J，EMERSON S U，et al.Identification by phage display and characterization of two neutralizing chimpanzee monoclonal antibodies to the hepatitis E virus capsid protein[J].J Virol，2000，74(12):5548- 5555．

[9] MENG J，DAI X，CHANG J C，et al.Identification and characterization of the neutralization epitope(s) of the hepatitis E virus[J].Virology，2001，288(2):203- 211．

[10] ZHOU Y H，PURCELL R H，EMERSON S U.An ELISA for putative neutralizing antibodies to hepatitis E virus detects antibodies to genotypes 1，2，3，and 4[J].Vaccine，2004，22(20):2578- 2585．

[11] 張紅梅，孟繼鴻，戴星，等.一個能誘生戊型肝炎病毒中和抗體的ORF2編碼蛋白短片段[J].分子與細胞免疫學(xué)，2007，23(6)：483- 487．