復(fù)元膠囊對(duì)大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨中ADAMTS-4、5的影響

鄧紫婷 周?chē)?guó)慶 李榮亨 李 強(qiáng) 曾 麗

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，重慶 400016)

骨關(guān)節(jié)炎(OA)主要特征為關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的凋亡和細(xì)胞外基質(zhì)的進(jìn)行性降解〔1〕。蛋白聚糖酶屬于帶有血小板反應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)域單元的裂解素和金屬蛋白酶(ADAMTs)家族。近年研究發(fā)現(xiàn)在OA早期，ADAMTS是降解蛋白多糖的主要酶系，比基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)作用大約提前3 w左右，且抑制ADAMTS-4和ADAMTS-5能有效防止關(guān)節(jié)軟骨的破壞，其降解部位主要在蛋白多糖核心蛋白球間區(qū)域(IGD)的Glu373-Ala374作用位點(diǎn)〔2,3〕。復(fù)元膠囊是在長(zhǎng)期臨床實(shí)踐的基礎(chǔ)上總結(jié)出來(lái)的治療OA的中藥復(fù)方制劑，臨床觀(guān)察發(fā)現(xiàn)其對(duì)OA的療效確切，不良反應(yīng)少。前期研究顯示，復(fù)元膠囊通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子、MMPs及其抑制劑(TIMPs)和生長(zhǎng)因子之間的平衡〔4〕，抑制軟骨中誘導(dǎo)性一氧化碳合酶(iNOS)的表達(dá),減少NO的產(chǎn)生〔5〕，減少Ⅱ型膠原和蛋白多糖的降解〔6〕，促進(jìn)細(xì)胞增殖，減少細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮對(duì)OA的防治作用〔7〕。本文觀(guān)察不同濃度復(fù)元膠囊對(duì)關(guān)節(jié)軟骨中ADAMTS-4和ADAMTS-5表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1材料 雄性8周齡SD大鼠60只，體重(200±10)g，由重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK(渝)2012-0001。復(fù)元膠囊：重慶希爾安藥業(yè)公司生產(chǎn)(批準(zhǔn)文號(hào)：渝衛(wèi)2002〔42-33〕)，由黃芪、人參、川芎、丹參、淫羊藿、鹿角膠、肉蓯蓉、骨碎補(bǔ)、枸杞子等中藥組成，每粒0.41 g,每克粉末含生藥3 g；抗骨增生膠囊：江蘇康緣股份有限公司生產(chǎn),生產(chǎn)批號(hào)：110402。ADAMTS-4和ADAMTS-5多克隆抗體，購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司；SABC試劑盒及DAB顯色劑購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司；軟骨總提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒及2X Es Taq MasterMix(含染料)均來(lái)自于北京康為世紀(jì)；ADAMTS-4、ADAMTS-5及內(nèi)參GAPDH引物由TakaRa公司合成(見(jiàn)表1)；SDS-PAGE凝膠試劑盒、RIPA蛋白提取試劑盒均由碧云天公司生產(chǎn)。BX50型光學(xué)顯微鏡來(lái)自日本OLYMPUS公司；DNA engine PT-200 PCR儀、BIO-RAD電泳儀及BIO-RAD凝膠成像儀來(lái)自美國(guó)BIORAD公司。

表1 引物序列情況

1.2方法

1.2．1分組及造模 將60只大鼠隨機(jī)分為正常組，模型組，抗骨增生膠囊組，復(fù)元膠囊低、中、高劑量組，每組10只。Hulth法〔8〕建立OA模型，用10%水合氯醛按照0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉大鼠，在無(wú)菌條件下切斷大鼠右膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)副韌帶，完整切除內(nèi)側(cè)半月板及剪斷前后交叉韌帶逐層縫合，無(wú)菌包扎。術(shù)后給予肌注青霉素抗感染，共7 d。術(shù)后1 w開(kāi)始每天驅(qū)趕大鼠跑步30 min，共驅(qū)趕4 w。正常組大鼠不給予任何處理。

1.2.2給藥 依據(jù)Meeh-Rubner公式計(jì)算大鼠的等效給藥劑量，復(fù)元膠囊低、中、高劑量組分別給予復(fù)元膠囊371.65、743.30、2 229.90 mg·kg-1·d-1,抗骨增生膠囊組給予抗骨增生膠囊557 mg·kg-1·d-1, 均配置成3 ml溶液，正常組和模型組給予生理鹽水灌胃，于術(shù)后第2周開(kāi)始，每天灌胃1次，共4 w。

1.2.3光鏡觀(guān)察關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞及基質(zhì) 于治療后第4周處死各組大鼠共60只，觀(guān)察并記錄關(guān)節(jié)囊、滑膜、關(guān)節(jié)軟骨及關(guān)節(jié)液的一般情況，取脛骨平臺(tái)全層軟骨連同軟骨下骨標(biāo)本，將其中一部分放置在-80℃冰箱保存，一部分在4%多聚甲醛溶液中固定24 h，10%EDTA脫鈣15 d，常規(guī)石蠟包埋后切片，HE染色觀(guān)察軟骨組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞數(shù)量和潮線(xiàn)的完整性。依據(jù)Mankin法〔9〕評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分，0級(jí)為正常;1級(jí)為表層破壞;2級(jí)為血管翳及表層破壞;3級(jí)為淺層裂隙形成;4級(jí)為局限性深達(dá)骨質(zhì)的裂隙;5級(jí)為大面積深達(dá)骨質(zhì)的軟骨缺如;6級(jí)為負(fù)重區(qū)軟骨全部丟失。

1.2.4免疫組化法檢測(cè)關(guān)節(jié)軟骨中蛋白聚糖酶1、2的蛋白表達(dá) 切片脫蠟至水，3%H2O2室溫15 min滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。沖洗后PBS浸泡5 min，胰蛋白酶消化液修復(fù)抗原活性20 min，正常山羊血清封閉，分別滴加1∶50的稀釋抗大鼠ADAMTS-4和ADAMTS-5多克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)，4℃孵育過(guò)夜。PBS沖洗5 min，3次。滴加生物素標(biāo)記的二抗(武漢博士德)，37℃孵育30 min，PBS沖洗5 min，3次。滴加SABC-HRP(武漢博士德)，37℃孵育30 min。PBS沖洗5 min，3次。DAB室溫下顯色至滿(mǎn)意，自來(lái)水終止反應(yīng)。蘇木素復(fù)染3 min，洗去多余染液，鹽酸酒精分化2 s，碳酸鋰復(fù)染1 min，酒精梯度脫水后封片，顯微鏡下觀(guān)察。圖像分析：每個(gè)標(biāo)本取5張切片，每張切片OLYMPUS BX50顯微鏡下放大200倍，隨機(jī)取5個(gè)視野，采用Image-Pro Plus圖像分析軟件測(cè)定陽(yáng)性染色平均累積光密度(IOD)。

1.2.5關(guān)節(jié)軟骨總RNA提取和半定量RT-PCR檢測(cè)ADAMTS-4和ADAMTS-5的mRNA表達(dá) 取損傷區(qū)軟骨30 mg在液氮中研磨成粉末，然后用TRIzol提取總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)樣品吸光度(A)，A260/A280為1.8-2.0。每組取1 μl總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA(dNTP Mix,2.5 mmol/L Each 4 U、Primer Mix 2 μl、RNA Template 2 μl、5×RT Buffer 4 μl、DTT，0.1 mol/L、HiFi-MMLV,200 U/μl,1 μl、RNase-free Water 5 μl)。取cDNA 1 μl進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增完畢后取5 μl產(chǎn)物于含50 μl/L GoldViewTM核酸染料的1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，用BRO-RAD凝膠圖像分析軟件檢測(cè)各組目的基因及內(nèi)參的光密度值。

1.2.6Western印跡法檢測(cè)軟骨中ADAMTS-4和ADAMT-5的蛋白表達(dá)量 于-80℃中取出軟骨組織，用RIPA試劑盒(碧云天公司)提取蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度后，按每孔50 μg上樣，在10%的SDS-PAGE凝膠上電泳后，用濕法轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)至0.45 μm孔徑的PVDF膜上，用5%BSA在37℃條件下封閉2 h后，分別敷上抗ADAMTS-4、ADAMTS-5及抗β-actin的多克隆抗體(1∶50稀釋)，在4℃過(guò)夜，用TBST洗3次，每次15 min。然后分別敷上羊抗兔及抗小鼠抗體，37℃ 條件下放置1 h后，用TBST沖洗3次，每次15 min。在暗室中敷上BeyoECL發(fā)光液，用ChemiDoc XRS凝膠/發(fā)光圖像分析系統(tǒng)對(duì)蛋白條帶進(jìn)行顯影，并采用Quantitiy One軟件計(jì)算條帶的灰度值。

2 結(jié) 果

2.1HE染色后觀(guān)察軟骨組織 正常組軟骨組織4層結(jié)構(gòu)清晰，軟骨表層光滑平整，細(xì)胞排列整齊，基質(zhì)染色均勻,潮線(xiàn)清晰Mankin評(píng)分為(0.33±0.08)分；模型組軟骨組織層變薄，表層裂隙交錯(cuò)分布，細(xì)胞數(shù)目變少，排列紊亂，潮線(xiàn)嚴(yán)重?cái)嗔涯：齅ankin評(píng)分為(6.9±0.30)分；抗骨增生膠囊組軟骨表面欠光整，細(xì)胞層數(shù)增多，排列稍顯紊亂，潮線(xiàn)部分?jǐn)嗔袽ankin評(píng)分為(4.1±0.83分)；復(fù)元膠囊低劑量組軟骨表層可見(jiàn)少許裂隙，細(xì)胞數(shù)減少，排列紊亂，有空泡樣改變出現(xiàn)，潮線(xiàn)稍顯紊亂Mankin評(píng)分為(5.6±0.48)分；復(fù)元中劑量組軟骨組織染色較均勻，細(xì)胞層有增生且細(xì)胞數(shù)增多Mankin評(píng)分?jǐn)?shù)為(4.3±0.45)分；復(fù)元高劑量組軟骨組織表層尚且光滑平整，細(xì)胞有明顯增生，中深層有少量細(xì)胞簇聚，可見(jiàn)雙重潮線(xiàn)Mankin評(píng)分為(2.4±0.66)分。

2.2免疫組化法檢測(cè)軟骨組織中ADAMTS-4、ADAMTS-5的表達(dá) 正常組軟骨在表層見(jiàn)少許陽(yáng)性細(xì)胞；模型組及其余各組軟骨組織見(jiàn)不同程度著色，軟骨細(xì)胞的胞質(zhì)中可見(jiàn)黃色顆粒著色，ADAMTS-4和ADAMTS-5均主要在胞質(zhì)表達(dá)，以表層最為明顯；復(fù)元膠囊中劑量組和高劑量組與模型組相比，ADAMTS的表達(dá)有明顯減少，尤其以ADAMTS-5最為顯著，且復(fù)元高劑量組減少程度顯著(P<0.01)；與抗骨增生膠囊組比較，復(fù)元膠囊高劑量組ADAMTS-4及ADAMT-5表達(dá)低于抗骨增生膠囊組(P<0.01，P<0.05)。見(jiàn)表2，圖1，圖2。

表2 免疫化檢測(cè)軟骨組織中ADMAMTS-4、ADAMTS-5的表達(dá)(IOD，±s,n=10)

圖1 各組鼠軟骨組織中ADTS-4表達(dá)(DAB，×200)

圖2 各組鼠軟骨組織中ADAMTS-5表達(dá)(DAB，×200)

2.3RT-PCR法測(cè)定軟骨組織中ADAMTS-4和ADAMTS-5的mRNA表達(dá) 各組軟骨組織提取的RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增后，電泳顯示強(qiáng)弱不等的熒光(圖3)。經(jīng)圖像軟件分析結(jié)果顯示，模型組ADAMTS-4及ADAMTS-5表達(dá)顯著增加，與其余各組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與抗骨增生膠囊組比，復(fù)元膠囊高劑量組ADAMTS-4和ADAMT-5的mRNA的表達(dá)量明顯降低(P<0.05)，而復(fù)元膠囊低劑量組和中劑量組表達(dá)無(wú)明顯改變，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

2.4Western 印跡法測(cè)定軟骨組織中ADAMTS-4和ADAMTS-5的蛋白表達(dá) 與正常組比較，模型組軟骨組織中ADAMTS-4和ADAMTS-5的蛋白表達(dá)量顯著增高(P<0.01)；ADAMTS-4及ADAMTS-5在抗骨增生膠囊組和復(fù)元膠囊各組的蛋白表達(dá)量均較模型組顯著降低(P<0.01)，復(fù)元膠囊低劑量組和中劑量組較之抗骨增生膠囊組差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，復(fù)元膠囊高劑量組的表達(dá)量顯著低于抗骨增生膠囊組(P<0.05)。見(jiàn)圖4，表4。

表3 RT-PCR檢測(cè)軟骨組織中ADAMTS-4、ADAMTS-5的mRNA表達(dá)(目的/GAPDH,±s，n=10)

表4 蛋白印跡檢測(cè)軟骨組織中ADAMTS-4、ADAMTS-5的蛋白表達(dá)(目的/β-ACTIN,±s，n=10)

1.正常組;2.模型組;3.抗骨增生膠囊組;4.復(fù)元膠囊低劑量組;5.復(fù)元膠囊中劑量組;6.復(fù)元膠囊高劑量組

1.正常組;2.模型組;3.抗骨增生膠囊組;4.復(fù)元膠囊低劑量組;5.復(fù)元膠囊中劑量組;6.復(fù)元膠囊高劑量組

3 討 論

在OA病變?cè)缙?，以?xì)胞外基質(zhì)的降解為主，基質(zhì)主要由膠原和蛋白多糖構(gòu)成，其中蛋白多糖占關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)干重的40%，以軟骨聚集蛋白多糖的形式存在〔10〕。在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，只有蛋白多糖降解后Ⅱ型膠原才緩慢降解。MMPs和蛋白聚糖酶均能降解蛋白多糖，其中ADAMTS-4和ADAMTS-5是主要的蛋白聚糖酶〔11〕，ADAMTS-4與ADAMTS-5結(jié)構(gòu)相似，均具有前肽區(qū)、催化區(qū)、解聚素樣區(qū)、血小板凝血酶敏感蛋白樣序列1區(qū)(TSP-1)、半胱氨酸富含區(qū)及間隔區(qū)，其中ADAMTS-5還有一個(gè)血小板凝血酶敏感蛋白樣序列2區(qū)(TSP-2)，TSP區(qū)可與ECM結(jié)合，參與蛋白多糖的降解。蛋白聚糖酶可在多個(gè)位點(diǎn)裂解蛋白多糖，一是核心蛋白G2-G3的硫酸軟骨素富集區(qū)的4個(gè)位點(diǎn)；二是傳統(tǒng)球間區(qū)G1-G2(IGD)的作用位點(diǎn)。Glasson等〔12〕在敲除的ADAMTS-5和ADAMTS-4基因的小鼠實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在炎性和非炎性骨關(guān)節(jié)炎中，敲除ADAMTS-5基因可減少對(duì)小鼠軟骨組織中的蛋白多糖的降解，而敲除ADAMTS-4無(wú)此作用。Stanton等〔13〕通過(guò)在小鼠體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中證明去除ADAMTS-5活性能對(duì)抗蛋白多糖的降解。隨著基因敲除及轉(zhuǎn)基因技術(shù)的引入，蛋白聚糖酶對(duì)OA病程中蛋白多糖的降解作用得到進(jìn)一步確定，因此西醫(yī)做出大量的努力用來(lái)研發(fā)聚蛋白聚糖酶的小分子抑制劑〔14〕，在治療骨關(guān)節(jié)炎上尋找突破，而在中醫(yī)對(duì)OA的治療方面的研究才剛剛起步。

中醫(yī)認(rèn)為骨關(guān)節(jié)炎屬于“骨痹”范疇。其病因病機(jī)為：氣血不足，肝腎虧虛，風(fēng)寒濕侵入骨髓，痹阻經(jīng)絡(luò)導(dǎo)致筋骨失養(yǎng)，證屬肝腎虧虛、氣滯血瘀，治法以補(bǔ)腎壯骨，益氣活血為主。復(fù)元膠囊中人參、黃芪益氣活血，具有抗疲勞、抗缺氧、增強(qiáng)機(jī)體適應(yīng)能力的作用；川芎、丹參行氣活血，其有效成分川芎嗪和阿魏酸有改善微循環(huán)的作用，且有研究表明川芎嗪能有效防治骨關(guān)節(jié)炎。鹿茸、淫羊藿補(bǔ)腎壯陽(yáng)、強(qiáng)筋健骨，有調(diào)節(jié)免疫和促性腺激素樣作用，而研究發(fā)現(xiàn)性激素通過(guò)促進(jìn)軟骨細(xì)胞中生長(zhǎng)因子的表達(dá)，抑制多種炎癥因子的表達(dá) ，影響細(xì)胞外基質(zhì)的合成和降解，達(dá)到延緩OA的病程進(jìn)展的作用〔15〕。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，復(fù)元膠囊能夠通過(guò)抑制ADAMTS-4和ADAMTS-5的產(chǎn)生，減少蛋白多糖的降解，從而減輕關(guān)節(jié)軟骨的損傷，延緩0A的發(fā)展進(jìn)程。

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