Hsa-miR-9在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平及意義

胡 亮 韓建波 龍啟強(qiáng) 張郁豐 陶志堅(jiān) 易永祥

(東南大學(xué)附屬第二醫(yī)院腫瘤外科，江蘇 南京 210003)

內(nèi)源性非編碼小RNAs又稱微小〔RNA(miRNA)〕〔1〕不編碼蛋白質(zhì)，但可以通過降解或抑制靶mRNAs的翻譯來調(diào)節(jié)蛋白編碼基因的表達(dá)〔2〕,在調(diào)節(jié)生物體的生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞分化和凋亡及腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著非常重要的作用，能在轉(zhuǎn)錄后或者翻譯水平影響基因的表達(dá)，成為近年研究的熱點(diǎn)。與正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞中miRNA存在異常表達(dá)，包括異常上調(diào)或異常下調(diào)。多個(gè)研究發(fā)現(xiàn)，Hsa-miR-9在神經(jīng)腫瘤、乳腺癌、宮頸癌、食管癌、淋巴瘤的腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起重要作用〔3～8〕。由于miRNA具有組織特異性，不同細(xì)胞來源的腫瘤應(yīng)該會(huì)有不同的miRNA上調(diào)或下調(diào)〔9〕。本研究擬觀察Hsa-miR-9在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)水平，以及與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1病例標(biāo)本 結(jié)直腸癌組織標(biāo)本來自2004年1月至2007年6月初次就診且未同時(shí)合并其他腫瘤的結(jié)直腸癌手術(shù)患者，共66例。男44例，女22例；平均58.34歲；均為腺癌；高分化癌5例，中分化癌35例，低分化癌26例；病理pTNM(UICC2003分期標(biāo)準(zhǔn))分期：Ⅰ期6例，Ⅱ期31例，Ⅲ期21例，Ⅳ期8例。手術(shù)前均未接受放化療。

1.2qRT-PCR檢測(cè)Hsa-miR-9在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平 按照固定組織RNA提取試劑盒使用說明書從組織中提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA提取液的A260吸光度值，計(jì)算濃度后-20℃保存?zhèn)溆?。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說明書將所得總RNA逆轉(zhuǎn)錄為總cDNA，-20℃保存?zhèn)溆?。按照qRT-PCR試劑盒使用說明書，用qRT-PCR檢測(cè)結(jié)直腸癌標(biāo)本miR-9的表達(dá)水平。內(nèi)參選用U6、實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。用引物設(shè)計(jì)軟件Primer5.0設(shè)計(jì)qRT-PCR引物：Hsa-miR-9qRT-PCR引物：正向5′-ACACTCCAGCTGGGTCTTTGGTTATCTAGCT-3′，反向5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCATACAG-3′；U6-snRNAqRT-PCR引物：正向5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，反向5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′。PCR反應(yīng)條件：95℃ 5 min，95℃ 10 s，62℃ 45 s，共40個(gè)循環(huán)。

1.3統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS13.0軟件行t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

結(jié)直腸癌組織Hsa-miR-9表達(dá)水平的高低與年齡、性別、腫瘤發(fā)生部位、大體形態(tài)無顯著相關(guān)性(均P>0.05)，而與腫瘤分化程度、腫瘤浸潤(rùn)程度、有無淋巴轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)。見表1。

表1 結(jié)直腸癌組織中Hsa-miR-9表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系

3 討 論

人miR-9有23個(gè)核苷酸，有3種類型：miR-9-1、miR-9-2和miR-9-3，分別定位于1q22、5q14.3、15q26.1，在多種腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。只有成熟的miRNA-9才能發(fā)揮作用，與其他蛋白質(zhì)組成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RISC)，該復(fù)合體與靶mRNA結(jié)合，從而引起靶mRNA的降解或翻譯抑制〔10,11〕。當(dāng)miRNA與靶基因結(jié)合位點(diǎn)完全互補(bǔ)配對(duì)時(shí)引起mRNA降解，不完全互補(bǔ)配對(duì)則導(dǎo)致翻譯抑制〔12～14〕。在人和動(dòng)物體內(nèi)，大部分miRNA與靶mRNA間的堿基配對(duì)為不完全互補(bǔ)配對(duì)，因而主要造成mRNA翻譯的抑制，而不是mRNA的降解〔15〕。在腫瘤組織中染色體常發(fā)生缺失、增加或重排現(xiàn)象，而miRNA位于染色體的脆性位點(diǎn)，因此異常表達(dá)的miRNA可能在腫瘤形成中扮演重要角色，可能是控制細(xì)胞增殖和調(diào)亡的抑癌基因或致癌基因〔16,17〕。miRNA表達(dá)的改變可以導(dǎo)致遺傳信息表達(dá)的改變從而導(dǎo)致相應(yīng)的病理生理狀態(tài)，而處于一定病理生理狀態(tài)的組織常伴有特定的miRNA表達(dá)〔18〕。miR-9在多種腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。對(duì)腫瘤miRNA表達(dá)研究可有助于多種癌癥的分型和預(yù)后判斷〔19〕。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Hsa-miR-9表達(dá)水平與結(jié)直腸癌的臨床病理特征以及臨床分期之間有相關(guān)性，隨著結(jié)直腸癌的病情進(jìn)展而表達(dá)水平增高。當(dāng)腫瘤浸潤(rùn)程度增加，分化程度惡化，出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移時(shí)患者癌組織中Hsa-miR-9的表達(dá)水平明顯升高。提示miRNA與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究證實(shí)了Hsa-miR-9在結(jié)直腸癌進(jìn)展不同臨床階段患者中存在顯著差異，結(jié)直腸癌患者癌組織中Hsa-miR-9表達(dá)水平高低可能成為一個(gè)評(píng)價(jià)疾病進(jìn)展及不良預(yù)后的獨(dú)立指標(biāo)。

4 參考文獻(xiàn)

1Lagos-Quintana M，Rauhut R，Lendeckel W,etal．Identification of novel genes coding for small expressed RNAs〔J〕．Science，2001;294(5543):853-8．

2Bartel DP．MicroRNAs: genomics，biogenesis，mechanism，and function〔J〕．Cell，2004;116(2):281-97．

3Ciafre SA, Galardi S, Mangiola A,etal. Extensive modulation ofa set of microRNAs in promary glioblastoma〔J〕.Biochem Biophys Res Commun, 2005; 334:1351-8.

4Nass D, R06enwald S, Meiri E,etal. MiR-92b and miR-9/9* are specifically expressed in brain primary tumors and can be used to differentiate primary from metastatic brain tumors〔J〕.Brain Palhol, 2009; 19:375-83.

5Lehmann U, Hasemeier B, Christgen M,etal. Epigenetic inactivation of microRNA gene hsa-mir-9-1 in human breast cancer〔J〕. J Pathol, 2008; 214(1): 17-24.

6Hu X, Schwarz JK, Lewis JS Jr,etal. A microRNA expression signature for cervical cancer prognosis〔J〕. Cancer Res, 2010; 70(4):1441-8.

7Hu Y, Correa AM, Hoque A,etal. Prognostic significance of differentially expressed miRNAs in esophageal cancer〔J〕. Int J Cancer, 2011; 128(1): 132-43.

8Onnis A, De Falco G, Antonicelli G,etal. Alteration of microRNAs regulated by c-Myc in Burkitt lymphoma〔J〕. PLoS One, 2010; 5(9): el2960.

9Barad O, Meiri E, Avniel A,etal. MicroRNA expression detected byoligonucleotide microarrays system establishment and expression profiling inhuman tissues〔J〕. Genome Res, 2004;14(12):2486-94．

10Bohnsack MT,Czaplinski K, Gorlich D. Exportin 5 is a RanGTP-dependent dsRNA-binding protein that mediates nuclear export of pre-miRNAs〔J〕. RNA,2004;10(2):185-91．

11Yekta S, Shih IH, Artel DE. MicroRNA-directed cleavage of HOXB8 mRNA〔J〕. Science,2004;304(5670):594-6.

12Boden D, Pusch O, Silbermann R,etal. Enhanced gene silencing of HIV-Ispecific siRNA using microRNA designed hairpins〔J〕. Nucleic Acids Res,2004;32:1154-8.

13Yu Z, Raabe T, Hecht NB. MicroRNA Mirn 122a reduces expression of theposttranscriptionally regulated germ cell transition protein 2(Tnp2)messengerRNA(mRNA)by mRNA cleavage 〔J〕. Biol Reprod,2005;73:427-33.

14Ambros V. The functions ofanimal microRNAs 〔J〕. Nature,2004;43(1):350-5.

15Pfeffer S. Identification of virus-encoded microRNA〔J〕. Science, 2004;304:734-6.

16Calin GA, Dumitru CD, Shimizu M,etal. Frequent deletions and down-regulationof microRNA genes miRl5 and miRl6 at 13q14 in chronic lymphocyticLeukemia〔J〕. Proc Natl Acad Sci USA, 2002;99:15524-9.

17Nairz K, Rottig C, Rintelen F,etal. Overgrowth caused by misexpression of a microRNA with dispensable wild-type function〔J〕. Dev Biol, 2006;291:314-24.

18Cohn DE, Fabbri M, Valeri N,etal. Comprehensive miRNA profiling of surgically staged endometrial cancer〔J〕. Am J Obstet Gynecol, 2010; 202(6): 656. e1-e8.

19Cummins JM，Velculescu VE．Implications of micro-RNA profiling for cancer diagnosis〔J〕．Oncogene，2006; 25:6220-7．