神經生長因子對木糖誘導白內障大鼠晶狀體的保護作用

劉宏偉 孟 巖 張 劍 姜 偉 王玉清

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院眼科，黑龍江 佳木斯 154002)

我國目前就有白內障患者500多萬，急需手術治療的白內障盲人就有近200萬，每年新增的白內障盲人就有約(40～120)萬，白內障目前還沒有明確有效的治療藥物，治療手段主要是手術治療，而手術畢竟是一種創(chuàng)傷性治療手段且費用較高。研究表明大多數動物細胞應激反應時，過量表達神經生長因子(NGF)〔1〕。本研究擬探討NGF對白內障大鼠的保護作用及發(fā)病機制。

1 材料和方法

1.1實驗藥品與試劑 199培養(yǎng)基、小牛血清、外源性NGF、D-木糖、NGF抗體、抗兔二抗均購自上海圻明生物科技有限公司，離心機、酶聯免疫檢測儀等由佳木斯大學生命科學實驗中心提供。

1.2動物分組 Wistar大鼠40只(由佳木斯大學實驗動物中心提供)，體質量(180±20)g，隨機分為空白對照組、模型組、NGF組、對照組，每組各10只，適應性喂養(yǎng)1 w后，采用10%水合氯醛麻醉并在無菌條件下處死大鼠，并取大鼠眼球，冰冷生理鹽水沖洗后浸入0.1%新潔爾滅溶液1 min，再以新鮮除菌培養(yǎng)液沖洗數次，然后在無菌操作下解剖眼球取出晶體，分別投入試管中，每個試管中含液體3 ml，空白對照組試管中加入199培養(yǎng)液60%，小牛血清40%。模型組試管中加入199培養(yǎng)液60%，0.29 mol/L D-木糖溶液20%，小牛血清20%。NGF組試管中加入199培養(yǎng)液20%，0.29 mol/L D-木糖溶液20%，小牛血清20%，NGF 40%。對照組試管中加入199培養(yǎng)液20%，0.29 mol/L D-木糖溶液20%，小牛血清20%，生理鹽水40%，加蓋后置于37℃水育箱中培養(yǎng)。分別在24、48、72 h觀察晶狀體渾濁度，并用酶聯免疫吸附(ELISA)法測定空白對照組和模型組內源性NGF的含量。

1.3晶體渾濁度觀察 按照何守志等〔2〕報道的方法對晶狀體混濁程度進行分期并計分：0期：用裂隙燈顯微鏡觀察晶體清晰透明，計 0分；Ⅰ期：囊泡初期，晶體周邊部皮質出現細小囊泡或細小囊泡群，計1 分；Ⅱ期：囊泡期，晶體皮質區(qū)呈現細小囊泡，中等囊泡自赤道部向前皮質擴展，逐漸形成環(huán)狀或戒指狀，囊泡群環(huán)帶逐漸加寬至前皮質的 1/2～ 2/3 半徑，計 2分；Ⅲ期：皮質期，晶體皮質呈現不規(guī)則條紋狀、箭竹狀并向前極放射的混濁灶，逐漸形成彌漫性灰色至灰白色混濁，晶體核尚透明，計3分；Ⅳ期：核混濁期，除晶體皮質灰白混濁外，晶體核密度增高，出現致密灰色至乳白色或白色混濁，計4分；Ⅴ期：成熟白內障期，晶狀體皮質及核完全呈灰白色混濁，計5分。

1.4ELISA 利用鼠β-NGF ELISA試劑盒按產品說明書步驟進行操作，收集各組晶狀體勻漿上清液，加入預先包被有NGF多克隆抗體的96孔板內，4℃孵育24 h。洗去多余抗體，加入生物素標記的兔抗鼠IgG室溫孵育2 h。最后加入終止液，37℃孵育25 min。在酶聯免疫檢測儀(Bio-Rad 680)OD 450 nm處測量各孔吸光值，系統(tǒng)精密度為最小1.0 ng/ml。每組樣品重復實驗2次。

1.5統(tǒng)計學分析 采用SPSS13.0軟件進行單因素方差分析和q檢驗。

2 結 果

空白對照組晶狀體渾濁度分數1分，模型組120分，對照組112分，NGF組79分。模型組較空白對照組渾濁度系數明顯增高(P<0.05)。而NGF組較對照組渾濁度系數明顯降低(P<0.05)。見表1。

模型組24、48、72 h NGF濃度〔(18.951±4.021)、(10.173±11.511)、(6.098±20.001)pg/ml〕均明顯高于空白對照組〔(0.375±0.021)、(0.897±0.083)、(1.145±1.003)pg/ml〕(P<0.05)。模型組24、48、72 h NGF濃度隨時間推移而下降(P<0.05)。

表1 各組大鼠在24、48、72 h晶狀體渾濁度(n=10)

3 討 論

現已公認晶狀體透明度的維持是由其組成蛋白質的構象決定的，天然蛋白的穩(wěn)定性決定了蛋白構象的穩(wěn)定，蛋白質四級結構的維持依賴于新合成多肽的合理折疊和細胞對環(huán)境或病理生理應激產生的足夠的保護作用。蛋白質天然結構的不穩(wěn)定導致晶狀體的混濁，因而詳細了解晶狀體蛋白如何長期維持其天然結構是非常必要的。晶狀體獨特的解剖位置使其長期暴露于一種應激的環(huán)境中。 由于晶狀體沒有直接的血供，因此一些必不可少的生物大分子如氧或氨基酸的供應是有限的，而代謝廢物如毒素、炎性物質在附近長期保留。 所以，晶狀體需要特殊的保護作用以抵抗微環(huán)境誘導的應激。如果沒有這樣的保護作用，晶狀體蛋白質將降解而導致白內障。NGF能夠促進發(fā)育中的感覺神經元及交感神經元的存活和分化，營養(yǎng)成熟神經元，維持其正常的生物學功能，具有抑制細胞凋亡〔3〕，保護視神經的作用迅速成為生命科學界所矚目的焦點〔4〕。

本實驗提示NGF可延緩白內障的發(fā)生，可以作為白內障疾病一種新的治療途徑。NGF在身體各部位都可發(fā)現其表達，尤其是在機體受到外界因素干擾時，含量可增高。機體自身存在一定的內源性NGF，特別是在加入D-木糖后，晶狀體中內源性NGF含量也明顯增高，這一現象說明機體存在一定的自我保護作用，但其作用較微弱，達不到抑制晶狀體渾濁的作用。白內障的發(fā)生可減少NGF的產生，從而降低NGF對晶狀體的保護作用。

4 參考文獻

1Leppa S，Kajanne R，Arminen L，etal.Differentiation induction of HSP70-encoding genes in human hematopoietic cells〔J〕.J Biochem，2001；276：31713-9.

2何守志，尹素云，宋 深.半乳糖性白內障形成及逆轉的實驗研究〔J〕.中華眼科雜志，1987;23(1):39-42.

3王麗輝，童坦軍.神經生長因子〔J〕.生物化學與生物物理學進展,1998;19(1)：29.

4Lindsay RM，Hamer AJ.Nerve growth factor regulates expression of neuropeptide genes in adult sensory neurons〔J〕.Nature，1989;337：362.