CXC趨化因子配體5對前列腺癌細胞生長的作用

齊亞靈 王偉群 張建華 趙曉蓮 張 坤 于海波 賈秀月 齊淑芳 邵明亮

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

前列腺癌發(fā)病率具有明顯的地理和種族差異。在歐美國家，前列腺癌的發(fā)病率最高，并且其病死率也僅次于肺癌，位于第二位。我國前列腺癌發(fā)病率每年以10%的速度快速增加。腫瘤的分子病理學(xué)機制錯綜復(fù)雜，多種生物分子都參與其發(fā)生與演進過程，目前眾多的研究已經(jīng)證實趨化因子及其受體在腫瘤的眾多生物學(xué)中扮演著重要角色〔1〕。趨化因子是一類能使細胞發(fā)生趨化作用的細胞因子，其可通過趨化因子受體廣泛參與細胞的生長、發(fā)育、分化、凋亡等多種生理功能，并在多種病理過程中如腫瘤的生長、存活、遷移、血管發(fā)生、白細胞浸潤等發(fā)揮重要作用。本研究探討CXC趨化因子配體(CXCL)5受體(CXCR2)在前列腺癌細胞的表達及CXCL5對前列腺癌細胞生長的作用。

1 材料與方法

1.1實驗用細胞、試劑及儀器 PC-3、DU145及LNCaP細胞(美國ATCC)；RPMI1640 培養(yǎng)基、優(yōu)質(zhì)胎牛血清及胰蛋白酶(美國Gibco公司)； RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所公司)；重組人CXCL5(美國PeproTech公司)；鼠抗人β-actin抗體、兔抗人CXCR2抗體(美國Santa Cruz公司)；青、鏈霉素、山羊抗小鼠IgG-HRP、山羊抗兔IgG-HRP、ECL顯影液(武漢博士德生物工程有限公司)；聚偏氟乙烯(PVDF)膜(美國Millipore公司)；EPS100 、EPS300電泳儀、垂直電泳槽、轉(zhuǎn)膜儀(上海天能科技有限公司)；全自動酶標儀(美國Biotek公司)。

1.2Western印跡檢測CXCL5 受體CXCR2在前列腺癌細胞中的表達 PC-3、DU145及LNCaP前列腺癌細胞接種于RPMI1640 培養(yǎng)基中(血清含量及雙抗?jié)舛确謩e為10%和100 U/ml )，并培養(yǎng)于CO2濃度為5%的37℃培養(yǎng)箱中。待細胞融合度達到80%以上后，收集細胞，RIPA裂解液裂解細胞，BCA方法測定各細胞株蛋白濃度。將30 μg總蛋白于12%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠中電泳后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜(270 mA 1 h)；5%脫脂奶粉室溫封閉2 h； PBST洗膜5 min×3次；鼠抗人β-actin(1∶500)抗體或兔抗人CXCR2抗體(1∶200)4℃孵育過夜；PBST洗膜10 min×3次；山羊抗小鼠IgG-HRP(1∶4 000)或山羊抗兔IgG-HRP(1∶4 000)37℃孵育45 min；PBST洗膜15 min×3次；ECL顯影液孵育膜2～3 min后置于暗盒中曝光，調(diào)整曝光時間并進行顯影和定影。實驗重復(fù)3次，以PC-3細胞β-actin條帶的灰度值為1，計算各條帶灰度值。各細胞株CXCR2與其內(nèi)參actin灰度值之比代表各細胞株CXCR2蛋白的相對含量。

1.3MTT法檢測重組人CXCL5對LNCaP細胞生長作用的影響 重組人CXCL5用0.1%BSA溶解并稀釋至適當(dāng)濃度，凍存于-80℃冰箱中備用。將對數(shù)生長的LNCaP細胞用RPMI1640培養(yǎng)基(血清含量及雙抗?jié)舛确謩e為5%和100 U/ml)接種于96孔板中，1.5×103個/孔。次日，將96孔板中的細胞分為4組(對照組與實驗組)，每組6孔。對照組用上述培養(yǎng)基+0.1%BSA培養(yǎng)(CXCL5終濃度為0 ng/ml)；實驗組用上述培養(yǎng)基+CXCL5培養(yǎng)(實驗組CXCL5終濃度分別為5，10，20 ng/ml)。從加入CXCL5后培養(yǎng)至第3天，各組細胞換各自的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，至第6天用MTT法檢測細胞增殖情況。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1CXCR2蛋白在前列腺癌細胞中的表達情況 CXCR2在DU145和LNCaP細胞中表達量較高，而在PC-3細胞中其表達量則較低，PC-3、DU145和LNCaP細胞目的基因蛋白CXCR2與內(nèi)參actin灰度值之比分別為0.36±0.056，1.44±0.107，1.65±0.089(P<0.05)(圖1)。

圖1 CXCR2蛋白在前列腺癌細胞的表達

2.2重組人CXCL5促進LNCaP細胞的生長 對照組及5、10、20 ng/ml組細胞的吸光度值分別為0.52±0.14，0.55±0.06，0.61±0.08和0.73±0.10。與對照組比較，20 ng/ml組增長率明顯增高(P<0.05)，這說明CXCL5可以明顯促進前列腺癌細胞LNCaP的增殖。

3 討 論

趨化因子是一類可介導(dǎo)細胞遷移、細胞激活、細胞分化和血管發(fā)生等多種功能的小分子物質(zhì)。按多肽鏈一級結(jié)構(gòu)不同，趨化因子可分為CXC、CC、C和CX3C等四個亞家族(C為半胱氨酸，X為任意氨基酸)。其中，靠近N端兩個半胱氨酸(Cys)之間插有任意一個氨基酸的被稱為CXC亞家族，同理，插有任意3個氨基酸的被稱為CX3C亞家族。目前CXC家族已發(fā)現(xiàn)16個成員，按其結(jié)構(gòu)功能區(qū)第一個半胱氨酸前是否存在ELR結(jié)構(gòu)(谷氨酸-亮氨酸-精氨酸，Glu-Leu-Arg)，進一步將其分為ELR+CXC和ELR-CXC兩類。目前認為ELR+CXC 類趨化因子(如CXCL1、CXCL3和CXCL5等)可以通過表達于癌上皮細胞上的CXCR2受體而促進其增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲，并介導(dǎo)血管發(fā)生〔2～4〕。而ELR-CXC 趨化因子如CXCL4、CXCL9和CXCL10則可抑制內(nèi)皮細胞的趨向性，從而抑制血管發(fā)生。有報道〔5〕表明，胰腺癌中CXCL5可通過激活A(yù)kt、ERK和STAT等信號通路而介導(dǎo)血管發(fā)生，并且CXCL5過表達與胰腺癌的低分化、高分期以及短期存活率密切相關(guān)。這與之前研究〔6〕的CXCL5在前列腺癌組織的表達率明顯高于前列腺增生組織的結(jié)果相一致。本實驗結(jié)果可見，與其他惡性腫瘤的研究結(jié)果相似，外源性重組CXCL5可促進前列腺癌細胞LNCaP的生長。之所以選擇LNCaP做生長實驗，這是因為相對于其他兩株前列腺癌細胞(PC-3和DU145)，CXCR2在LNCaP細胞株的表達量相對較多，因此，外源性CXCL5對其作用可能會更加明顯。實驗結(jié)果也印證了先前提出的假設(shè)，即癌間質(zhì)表達的CXCL5以及癌上表達的CXCL5可分別通過旁分泌和自分泌作用于癌上皮的CXCR2受體而參與前列腺癌的發(fā)展與演進過程〔6〕；為進一步建立過表達CXCL5的前列腺間質(zhì)細胞和癌上皮細胞細胞株，開展CXCL5旁分泌和自分泌機制研究奠定了堅實基礎(chǔ)。

4 參考文獻

1Balkwill F.Cancer and the chemokine network〔J〕.Nat Rev Cancer,2004; 4(7):540-50.

2Kakinuma T,Hwang ST.Chemokines,chemokine receptors,and cancer metastasis〔J〕 .J Leukoc Biol,2006;79(4):639-51.

3Ben-Baruch A.The multifaceted roles of chemokines in malignancy〔J〕.Cancer Metastasis Rev,2006;25(3):357-71.

4Okabe H,Beppu T,Ueda M,etal.Identification of CXCL5/ENA-78 as a factor involved in the interaction between cholangiocarcinoma cells and cancer-associated fibroblasts〔J〕.Int J Cancer,2012;131(10):2234-41.

5Li A,King J,Moro A,etal.Overexpression of CXCL5 is associated with poor survival in patients with pancreatic cancer〔J〕.Am J Pathol,2011; 178(3):1340-9.

6王偉群,孟德欣,齊亞靈,等.趨化因子CXCL5在前列腺癌組織表達的研究〔J〕.生殖與避孕,2012; 32(7):449-51.