呼出氣冷凝液檢測炎性指標監(jiān)測在慢性阻塞性肺疾病患者中的臨床應(yīng)用

張旭東

(慈溪市第三人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科,浙江 慈溪 315324 )

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種慢性呼吸道炎癥疾病，表現(xiàn)為不完全可逆的氣流受限、慢性缺氧和肺功能減退。目前COPD發(fā)病機制尚未明確，主要認為其與免疫細胞引起的炎癥反應(yīng)及蛋白酶失衡，氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。COPD患者呼吸道內(nèi)細胞毒性淋巴細胞、中性粒細胞和肺泡巨噬細胞等炎癥性細胞數(shù)量增加，易于發(fā)生氣道高反應(yīng)。近年來研究發(fā)現(xiàn)采用呼出氣冷凝液(EBC)檢測得到的生化標志物可以反映機體的氧化應(yīng)激或炎癥狀態(tài)〔1,2〕。EBC檢測是一種完全無創(chuàng)的檢測方法，但因其檢測方法、標志物種類選擇及標志物的參考值范圍都沒有標準化，因而該方法還在探索研究。本文旨在探尋EBC中生化標志物在臨床上應(yīng)用于反映COPD患者呼吸功能、呼吸道炎癥狀態(tài)與程度的意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2012年6月至2013年9月在本院呼吸內(nèi)科就診的老年COPD患者86例，43例體檢人群，分為COPD急性期組、COPD緩解期組及對照組。所有患者和體檢人群都具有吸煙史(表1)。診斷標準為2007年中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會《慢性阻塞性肺疾病診治指南》〔3〕。其中包括43例急性加重患者，診斷標準為患者近期有咳嗽、咳痰等急性起病和癥狀加重的臨床表現(xiàn)，如呼吸困難、咳嗽和多痰超出正常的日間變異。排除X線胸片確診肺炎者及近2 w使用抗生素者或呼吸系統(tǒng)以外部位存在細菌感染者；43例緩解期患者，診斷標準為已經(jīng)3個月未出現(xiàn)咳嗽、咳痰、喘息及呼吸困難癥狀者。另選擇同期體檢人群43例為正常對照組，入組前1個月無呼吸道感染史，肺功能檢查顯示無氣流阻塞。三組均排除有其他肺部疾患者；合并其他部位感染者；免疫系統(tǒng)疾病或于近期使用免疫抑制劑者；有嚴重心、肝、腎、內(nèi)分泌、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤及血液系統(tǒng)疾病者。研究對象均簽署知情同意書，研究設(shè)計及實施經(jīng)過本院倫理委員會批準。

1.2方法

1.2.1肺功能測定 采用德國Jaeger公司肺功能儀測定第1秒用力呼氣容積(FEV1)、用力肺活量(FCV)、FEV1%、FEV1/FVC。重復(fù)3次，兩次間最佳誤差<5%，取最大值。

1.2.2EBC檢測及收集 采用美國Respiratory Research公司的EBC收集裝置Rtube。受檢者于收集前靜坐休息15 min，用蒸餾水漱口3次，收集時取坐位，帶鼻夾，含住口器，保持口唇密閉，經(jīng)口平靜呼吸15 min。如有唾液則囑患者吞咽，如有咳嗽或噯氣則囑其脫開接口，待情況緩解后再繼續(xù)收集。收集量約為1～4 ml，每管約300 μl分裝于EP管中，凍存于-80℃冰箱待測。用酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)檢測EBC中的白細胞介素(IL)-4、IL-6、IL-8、腫瘤壞死因子(TNF)-α、8異前列腺素(8-iso-PG)及白三稀B4(LTB4)水平。按照美國Jackson公司試劑盒說明書進行操作，計算相應(yīng)標本的各生化指標含量。

表1 一般情況與肺功能檢測結(jié)果

2 結(jié) 果

2.1EBC檢測結(jié)果 COPD急性期患者EBC中IL-6、IL-8、8-iso-PG及LTB4均高于緩解期和正常對照組(P<0.05)，而IL-4、TNF-α則未發(fā)現(xiàn)有差別；COPD緩解期患者IL-6、8-iso-PG及LTB4高于正常對照組(P<0.05)，而IL-4、IL-8、TNF-α則未發(fā)現(xiàn)有差別。見表2。

2.2EBC中各指標相關(guān)性分析 EBC中IL-4、IL-6、IL-8、TNF-α、 8-iso-PG及LTB4與各臨床指標相關(guān)性進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EBC檢測物中只有IL-8與FEV1/FVC呈負相關(guān)，LTB4與FEV1呈負相關(guān)，其余未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性。見表3。

表2 呼出氣冷凝液檢測IL-4、IL-6、IL-8、TNF-α、 8-iso-PG及LTB4比較結(jié)果

表3 EBC檢測標志物與臨床指標的相關(guān)性(r值)

3 討 論

COPD發(fā)病機制復(fù)雜，其中涉及多種細胞組分參與炎癥反應(yīng)過程。中性粒細胞、TNF-α、IL家族、LTB4等都是重要的炎性細胞，它們的聚集活化都是COPD炎癥過程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)〔4〕。此外，肺組織的氧化應(yīng)激易造成呼吸道損傷，也容易使炎性細胞滯留于肺組織，同時還具有活化調(diào)節(jié)釋放炎性因子，加重各類炎性細胞的聚集。炎癥反應(yīng)和氧化損傷還能使蛋白酶/抗蛋白酶失衡〔5〕。因此，對COPD患者發(fā)病過程的各類炎性細胞表達監(jiān)測有利于判斷患者病情、觀察療效進而指導(dǎo)臨床用藥。

既往的手段主要是依據(jù)臨床表現(xiàn)，患者癥狀體征、血氣分析、肺功能檢查等，但是這些均無法直接體現(xiàn)肺部炎癥活動的狀態(tài)和程度；而檢測手段則主要是痰誘導(dǎo)、支氣管肺泡灌洗液等，這類容易受到污染或者是侵入性的有創(chuàng)檢查，不僅不易反復(fù)進行，而且也受到患者發(fā)病程度等的身體狀況制約〔6〕。EBC檢測是近年來逐漸興起的檢查手段，氣道內(nèi)襯液體中的生化分子，平靜呼吸時可隨氣體呼出，遇冷則隨水蒸氣凝結(jié)成為EBC的主要組成部分。EBC包含三大組成成分：水、過氧化氫及其他揮發(fā)性有機物；不易揮發(fā)也不易溶于水的細胞因子、前列腺素、LTB4等；無法揮發(fā)但易溶于水的蛋白類物質(zhì)。EBC的檢測因為不參與疾病的病理生理過程，且操作簡單安全，適用于各年齡層和各種患病程度的患者。此外，EBC還能連續(xù)反復(fù)收集，成為一種實時反映呼吸道炎癥情況的理想檢測方法。

本研究結(jié)果證實COPD急性期和緩解期患者均存在氧化應(yīng)激和炎癥損傷反應(yīng)，且表現(xiàn)出炎癥反應(yīng)在疾病過程中顯示的不同程度。EBC中不揮發(fā)物質(zhì)主要是花生四烯酸的代謝產(chǎn)物。 8-iso-PG 是細胞膜受到活性氧損傷后,脂質(zhì)花生四烯酸發(fā)生過氧化的代謝物，具有穩(wěn)定性良好的特點。LTB4則是花生四烯酸經(jīng)過5-脂氧酶(5-LO)代謝途徑形成的產(chǎn)物，在刺激下，各類細胞像單核細胞、巨噬細胞、淋巴細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、肥大細胞等都能產(chǎn)生LTB4〔7〕。EBC中的IL家族成員，如IL-4、IL-6、IL-8則是中性粒細胞的趨化因子，即在炎癥反應(yīng)發(fā)生時，可從血液中募集大量中性粒細胞，而炎癥反應(yīng)過程中，活化的細胞又會不斷分泌，進而加重炎癥反應(yīng)〔8〕。而TNF-α可以誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)發(fā)生，促進中性粒細胞黏附于呼吸道，也對呼吸道炎癥發(fā)展起著重要的作用，有研究認為它主要在吸煙的COPD患者與正常對照的吸煙者中顯現(xiàn)出差別〔9,10〕。

同樣的生化標志物在EBC中與在傳統(tǒng)檢測標本中,如誘導(dǎo)痰中的濃度并不相同,有些標志物在EBC中的濃度要低些,可能與二者來源不同有關(guān),EBC來自于氣道內(nèi)襯液形成的氣溶膠顆粒,而誘導(dǎo)痰則是氣道杯狀細胞核黏液腺細胞受刺激分泌產(chǎn)生,研究發(fā)現(xiàn)COPD緩解期和急性期二者所表現(xiàn)出來有不同的標志物,以及與其他研究不同的結(jié)果之處,可以發(fā)現(xiàn),EBC檢測方法更適用于急性期COPD〔11〕。

綜上，在EBC檢測中，雖然目前尚未制定出正常參考值范圍、還未建立靈敏度較高的EBC檢測方法及EBC所采集到的生物標志物來源還不能準確定位，但是并不影響EBC作為一種完全無創(chuàng)、安全、簡便的檢測技術(shù)的推廣和應(yīng)用，其中像IL-6、IL-8、8-iso-PG及LTB4這些炎性指標在監(jiān)測呼吸道炎癥動態(tài)方面已經(jīng)逐漸顯示出應(yīng)用價值。

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