P-選擇素在基因敲除小鼠肺轉(zhuǎn)移中的作用研究

亓翠玲 李斌 楊揚 葉杰 王麗京 黃韌

P-選擇素是選擇素家族的重要成員，主要在活化的血小板和血管內(nèi)皮細(xì)胞上表達，可以通過與單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞表面的P-選擇素配體結(jié)合，從而介導(dǎo)活化血小板或內(nèi)皮細(xì)胞與中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞黏附，因而P-選擇素在血栓形成和炎癥中發(fā)揮重要作用[1-3］。P-選擇素還可與腫瘤細(xì)胞表面的配體結(jié)合介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞與血小板及內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，從而促進腫瘤轉(zhuǎn)移，但P-選擇素對于黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移的作用尚未見報道，本研究利用P-選擇素敲除小鼠觀察P-選擇素對黑色素瘤細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移的作用。

材料與方法

一、腫瘤細(xì)胞和實驗動物

B16黑色素瘤細(xì)胞株購于上海細(xì)胞生物研究所，常規(guī)培養(yǎng)于含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中。P-選擇素敲除的小鼠 （P-sel-/-）購自Jackson lab（小鼠背景為C57），6～8周齡。C57小鼠，購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，6～8周齡，在無特定病原體（SPF）條件下飼養(yǎng)。

二、肺轉(zhuǎn)移模型建立

1.實驗動物分組和建模

P-選擇素敲除雌性小鼠（16只）為實驗組，以C57雌性小鼠（15只）作為對照組。取對數(shù)生長期B16F10細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后用無血清培養(yǎng)液重懸收集細(xì)胞，用無菌PBS調(diào)整細(xì)胞密度。用臺盼藍(lán)染細(xì)胞確定活細(xì)胞數(shù)在95%以上，于每只小鼠尾靜脈注射1×105個（0.2 ml）細(xì)胞。

2.腫瘤轉(zhuǎn)移觀察

在接種腫瘤細(xì)胞的第21天，用斷頸法處死小鼠，分離小鼠的肺組織，在10倍倒置顯微鏡下計數(shù)肺表面的轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的數(shù)目，只要有黑色轉(zhuǎn)移灶就算一個轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)。

三、HE染色步驟

石蠟組織脫蠟至水，自來水沖洗，蘇木精液染色，流水稍洗去蘇木精液后，1%鹽酸乙醇酸化，稍水洗，促藍(lán)液返藍(lán)水洗后，用曙紅液染色，脫水后，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察結(jié)果。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件和Sigmaplot軟件處理（Mann-Whitney test），比較各組間是否具有顯著性差別。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、小鼠肺轉(zhuǎn)移情況

P-選擇素敲除小鼠和C57小鼠尾靜脈注射B16黑色素瘤細(xì)胞，在小鼠第21天時處死小鼠，分離肺組織，C57小鼠和P-選擇素敲除小鼠肺表面都有黑色的轉(zhuǎn)移瘤（見圖1）。P-選擇素敲除小鼠肺表面轉(zhuǎn)移的腫瘤結(jié)節(jié)的數(shù)目明顯比C57小鼠少，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （t=4.01，P=0.00015），見圖2。

圖1 小鼠尾靜脈注射B16黑色素瘤細(xì)胞第21天小鼠肺轉(zhuǎn)移腫瘤

圖2 C57小鼠和P-選擇素敲除小鼠肺表面轉(zhuǎn)移的腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)比較

二、HE染色證實小鼠肺組織中有B16細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移灶

P-選擇素敲除小鼠和C57小鼠肺組織固定包埋后，HE染色發(fā)現(xiàn)肺組織中確實有腫瘤轉(zhuǎn)移灶，見圖3。

討 論

黏附分子是一類能介導(dǎo)細(xì)胞間黏附以及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)黏附的糖蛋白。選擇素是細(xì)胞黏附分子家族成員之一，選擇素家族參與了炎癥發(fā)生、淋巴細(xì)胞歸巢、凝血以及腫瘤轉(zhuǎn)移等生理和病理過程。P-選擇素是黏附分子選擇素家族的重要成員。P-選擇素可以表達在活化的血小板和內(nèi)皮細(xì)胞表面，而許多腫瘤細(xì)胞表面存在P-選擇素配基[包括P選擇素糖蛋白配體-1（PSGL-1）、sia1vl Lewis X（sLex）等糖基結(jié)構(gòu)的糖蛋白、糖脂等］，如乳腺癌、結(jié)直腸癌、肺癌、肝癌、腎臟細(xì)胞癌、鱗狀上皮癌等，這些受體可與P-選擇素結(jié)合介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞與血小板及內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，從而促進腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移[4］。Reyes-Reyes等[5］表明P-選擇素可以通過PI3-K和p38 MAPK通路促進結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移。

圖3 C57小鼠和P-選擇素敲除小鼠肺轉(zhuǎn)移瘤組織HE染色后的顯微鏡下觀察

利用P-選擇素基因敲除小鼠研究發(fā)現(xiàn)，P-選擇素缺失會抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[6-8］。Iwamura等[9］觀察到P-選擇素在腫瘤中表達增加促進了新生血管形成，而且已經(jīng)提出細(xì)胞表面黏附分子和內(nèi)皮間的相互作用對于腫瘤的轉(zhuǎn)移和新生血管形成起了重要作用。利用基因敲除小鼠建立腫瘤研究模型是當(dāng)今腫瘤學(xué)研究的最新趨勢?；蚯贸∈竽Ｐ驮谀[瘤研究上具有其它模型無法比擬的優(yōu)勢：在不伴有藥物副作用的情況下，基因產(chǎn)物的作用被完全消除，因此可以研究單個基因在動物體內(nèi)的功能。在P-選擇素敲除小鼠體內(nèi)P-選擇素的功能完全缺失，因此可以利用此小鼠在體內(nèi)研究P-選擇素對腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的影響。

本研究將B16F10黑色素瘤細(xì)胞通過尾靜脈注射到P-選擇素敲除小鼠和C57小鼠體內(nèi)，建立肺轉(zhuǎn)移瘤模型，此模型具有腫瘤發(fā)生率高、易建立、均一性好、個體差異小等優(yōu)點。結(jié)果表明P-選擇素敲除小鼠B16F10黑色素瘤細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)明顯比C57小鼠少，提示P-選擇素缺失可能抑制了黑色素瘤的肺轉(zhuǎn)移，但P-選擇素對B16F10細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移的作用機制還不明確，需要進一步的探討。若對P-選擇素在腫瘤生長和轉(zhuǎn)移中的作用進一步探討，可能對于尋找理想的抗腫瘤治療靶點及判斷患者預(yù)后具有重要意義。

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