壯藥假蒟藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，廣西 南寧 530023；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001

壯藥假蒟藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

桂貞才1顏萍花2唐玉榮2甘日呈2

1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，廣西 南寧 530023；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001

目的對假蒟藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行研究。方法通過四大經(jīng)典鑒別法對假蒟進(jìn)行鑒別；按2010年版《中國藥典》附錄方法對假蒟的水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物進(jìn)行測定；采用HPLC對假蒟中α-細(xì)辛腦進(jìn)行含量測定和指紋圖譜研究。結(jié)果確定假蒟藥材鑒別方法、檢查限量，建立含量測定和指紋圖譜方法。結(jié)論建立的方法可為假蒟藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供實驗基礎(chǔ)。

假蒟；鑒別；含量測定；指紋圖譜；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

假蒟又稱假蔞、哈蒟、假荖等，過去一直當(dāng)作常見的祛風(fēng)濕類中草藥使用[1]，是中華跌打丸的重要原料之一，并收載于《中國藥典》2010版附錄中[2]。近年來人們發(fā)現(xiàn)，假蒟資源豐富、藥食兩用，是極具民族特色的植物藥[3]，已有生藥學(xué)及化學(xué)成分等的研究報道[4-5]。為進(jìn)一步完善其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，更好地開發(fā)利用資源，本文系統(tǒng)地進(jìn)行了相關(guān)研究，結(jié)果如下。

1 材料與儀器

1.1 藥材與試劑 假蒟采自廣西各地(見表1)，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)蔡毅教授鑒別為Piper sarmentosum Roxb.的干燥地上部分。α-細(xì)辛腦對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：10298- 0001)；乙腈為色譜純；水為超純水；其他試劑為分析純。

表1 假蒟的藥材來源

1.2 儀器 1100高效液相色譜儀系統(tǒng)(美國Agilent)；半自動輪轉(zhuǎn)切片機(Leica RM2145，山海天呈科技有限公司)；光學(xué)生物顯微鏡(DM2500，德國徠卡儀器公司)；電子分析天平(BP211D，德國賽多利斯)；臺式電熱恒溫干燥箱(GZX-DH-26X30-TBS，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)；箱式電阻爐(SXZ-4-10，上海實驗儀器廠有限公司)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-S4，金壇市醫(yī)療儀器廠)。

2 實驗方法與結(jié)果

2.1 性狀鑒別 通過對多地采集的標(biāo)本，用性狀鑒別法進(jìn)行研究，匯總其性狀鑒別特征如下：本品莖呈圓柱形，表面有細(xì)縱棱，節(jié)上有不定根。葉多皺縮，展開后呈闊卵形或近圓形，長6～14cm，寬5～13cm，基部淺心形；上面棕綠色，下面灰綠色，有細(xì)腺點；7條葉脈于葉背突出，脈上有極細(xì)小的粉狀短柔毛；葉柄長2～5cm，葉鞘長為葉柄的一半；有時可見與葉對生的穗狀花序。氣香，味辛辣。

2.2 顯微鑒別 通過對多地采集的標(biāo)本，用顯微鑒別法進(jìn)行研究，匯總其顯微鑒別特征如下。

2.2.1 莖橫切面 表皮細(xì)胞1列，外被角質(zhì)層；非腺毛由1～2個細(xì)胞組成。皮層外側(cè)有數(shù)列厚角組織，斷續(xù)呈環(huán)。中柱維管束20～25個，環(huán)列；韌皮部外側(cè)有半圓形纖維束；木質(zhì)部較寬，導(dǎo)管徑向排列；髓鞘纖維束明顯。髓部寬廣，髓中維管束5～7個，環(huán)列；中央有1分泌道，直徑245～460μm，可見棕黃色分泌物。皮層、髓部均有油細(xì)胞散在；細(xì)小淀粉粒可見(見圖1)。

2.2.2 本品粉末灰綠色 分泌道碎片易見，內(nèi)含細(xì)小顆粒狀分泌物。油細(xì)胞類圓形，直徑23～38μm。石細(xì)胞類圓形、類長方形，直徑26～79μm，壁孔明顯。非腺毛由1～2個細(xì)胞組成，長42～87μm。纖維、螺紋導(dǎo)管或梯紋易見(見圖2)。

2.3 薄層色譜鑒別 根據(jù)假蒟所含有化學(xué)成分的類型，對不同的提取方法、展開系統(tǒng)及顯色劑進(jìn)行反復(fù)考察，穩(wěn)定的薄層鑒別方法如下：取本品粉末1g，加甲醇20ml，加熱回流1h，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇5ml使溶解，作為供試品溶液。另取假蒟對照藥材1g，同法制成對照藥材溶液。再取α-細(xì)辛腦對照品適量，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(中國藥典2010年版一部附錄Ⅵ B)試驗，吸取上述三種溶液各10μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-丙酮(20:3)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%的磷鉬酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品和對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(見圖3)。

2.4 檢查

2.4.1 水分 照中國藥典2010年版一部附錄水分測定法(附錄IX H第二法)甲苯法測定，15批假蒟水分測定結(jié)果為 8.1%～12.0%(見表2)。初步擬定假蒟水分含量不得超過13.0%。

2.4.2 總灰分 照中國藥典2010年版一部附錄灰分測定法(附錄IX K)測定，15批假蒟總灰分測定結(jié)果為 11.0%～16.0%(見表2)。初步擬定假蒟總灰分含量不得超過17.0%。

2.4.3 酸不溶性灰分 照中國藥典2010年版一部附錄灰分測定法(附錄IX K)測定，15批假蒟酸不溶性灰分測定結(jié)果為 0.4%～3.1%(見表2)。初步擬定假蒟酸不溶性灰分含量不得超過3.7%。

2.5 浸出物 照水溶性浸出物測定法項下的冷浸法(中國藥典2010年版一部附錄X A)測定，15批假蒟水溶性浸出物測定結(jié)果為 18.6%～28.2%(見表2)。初步擬定假蒟浸出物含量不得少于15.0%。

2.6 α-細(xì)辛腦的含量測定 α-細(xì)辛腦為假蒟的主要成分，在其揮發(fā)油含量中含量高達(dá)40.33%[5]，對本品中α-細(xì)辛腦進(jìn)行含量測定，方法及結(jié)果如下。

2.6.1 色譜條件 采用phenomenex ODS2柱(250mm×4.60 mm,5 μm，)；流動相為乙腈-0.05%磷酸溶液(49∶51)；流速1.0 mL·min-1；檢測波長313 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。在上述條件下，各成分無干擾且完全分離，理論板數(shù)按α-細(xì)辛腦計算大于1×104，α-細(xì)辛腦對照品和假蒟供試品色譜圖見圖4。

2.6.2 溶液的制備 取α-細(xì)辛腦對照品1.95 mg，精密稱定，置10 ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，配制成0.195 mg·mL-1的α-細(xì)辛腦對照品溶液。稱取假蒟干燥粗粉0.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇20 ml，回流3 h，放冷，用50%甲醇補足損失的重量，用孔徑為0.45μm的微孔濾膜過濾，續(xù)濾液為供試品溶液。

2.6.3 樣品測定 不同采收時間采收的假蒟藥材15批，按“2.6.2”項下方法制成供試品溶液。分別精密吸取供試品溶液各10 μl，按“2.6.1”項條件進(jìn)樣，測定峰面積，按外標(biāo)法計算α-細(xì)辛腦的含量。假蒟中α-細(xì)辛腦含量在0.036%～0.507%之間(見表2)。

表2 假蒟水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物、α-細(xì)辛腦含量測定結(jié)果(n=3)

2.7 指紋圖譜的研究 指紋圖譜能較全面地反映生藥所含內(nèi)在化學(xué)成分的種類與數(shù)量，更加有效地體現(xiàn)了生藥成分的復(fù)雜性，因而在評價生藥內(nèi)在質(zhì)量方面更客觀，更符合傳統(tǒng)的中醫(yī)藥理論。本文收集了廣西產(chǎn)(桂東、桂南、桂西、桂中)樣品15批，用高效液相色譜法對假蒟指紋圖譜進(jìn)行研究，結(jié)果如下。

2.7.1 溶液的制備 精密稱取α-細(xì)辛腦對照品4.10mg，置10ml量瓶中，用適量甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.4100mg·ml-1的對照品溶液。取假蒟藥材干燥粉末約0.3g，精密稱定，精密加入50%甲醇20ml稱重，回流提取1h，放冷至室溫，加50%甲醇補足減失的重量，搖勻，靜置，取上清液，用微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

2.7.2 色譜條件 采用phenomenex C18ODS2柱(250 mm×4.6 mm，5μm)；流動相為乙腈-0. 05%磷酸，梯度洗脫(0～15 min：5%～20% 乙腈；15～25 min：20% 乙腈；25～55 min：20%～47% 乙腈；55～65 min：47%～58% 乙腈；65～70 min：58%～70% 乙腈；70～90 min：70%～85% 乙腈；90～100 min：85%～85% 乙腈)；流速1.0ml·min-1；檢測波長258 nm；柱溫30℃；進(jìn)樣量10μl。

2.7.3 指紋圖譜與共有峰的確定 按“2.7.2”項方法檢測15批假蒟藥材的指紋圖譜。將測試數(shù)據(jù)導(dǎo)入國家藥典委員會“中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004A)”軟件，經(jīng)校正，將譜峰自動匹配，生成對照圖譜；通過中藥指紋圖譜相似度評價軟件得假蒟HPLC指紋譜共有模式圖(見圖5)。結(jié)果表明，其中有15個主要色譜峰(占總峰面積90%以上)是15批假蒟藥材所共有的，以峰面積較大且分離度較好的12號峰(α-細(xì)辛腦)作為參照峰S。

2.7.4 指紋圖譜的相似度分析 將15批藥材樣本圖譜與對照圖譜比較，計算相似度。結(jié)果顯示，4批假蒟藥材相似度大于0.70，7批假蒟藥材相似度大于0.80，其余4批假蒟藥材相似度大于0.90。

3 討論

α-細(xì)辛腦為近年來的研究熱點之一[6,7]，具有很好的治療哮喘、毛細(xì)支氣管炎、癲癇、驚厥和降血脂等疾病的作用。假蒟揮發(fā)油的主要成分為α-細(xì)辛腦，含量高達(dá)40.33%[5]，以其作為化學(xué)對照品進(jìn)行薄層鑒別，具有一定的合理性。中藥材含有多種成分，常共同發(fā)揮臨床療效，有時甚至具有雙向調(diào)節(jié)作用，很難確定某一化學(xué)成分即是中醫(yī)用藥的唯一有效成分。況且，已有研究表明假蒟中α-細(xì)辛腦會受產(chǎn)地、采收季節(jié)、加工方法等影響[8-10]，故含量測定以α-細(xì)辛腦為指標(biāo)，只能間接地控制其質(zhì)量，應(yīng)與浸出物等指標(biāo)聯(lián)合使用。而指紋圖譜的應(yīng)用，較好地克服了單一成分含量測定的不足。通過指紋圖譜特征，能有效鑒定樣品的真?zhèn)位虍a(chǎn)地；通過指紋圖譜主要特征峰的面積或比例的制定，能有效控制樣品的質(zhì)量，確保樣品質(zhì)量的相對穩(wěn)定。假蒟指紋圖譜的研究，雖然取得了一定成果，但要用于其質(zhì)量監(jiān)控尚需進(jìn)一步完善。

綜上所述，本研究的結(jié)果，可為進(jìn)一步完善假蒟藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供實驗基礎(chǔ)。

[1]冼寒梅,鄧家剛.廣西臨床常見中草藥[M].南寧:廣西科學(xué)技術(shù)出版社,2007:107.

[2]國家藥典委員會.中國藥典[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:附錄550.

[3]廣西壯族自治區(qū)食品藥品監(jiān)督管理局.廣西壯族自治區(qū)壯藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[S].南寧:廣西科技出版社,2011:270.

[4]蔡毅,姜建萍,蘇建群,等.假蒟的生藥學(xué)鑒別[J].中國中藥雜志,2006,(5):434.

[5]蔡毅,董棟,么春艷,等.GC-MS分析廣西四種栽培胡椒屬植物葉揮發(fā)油的化學(xué)成分[J].華西藥學(xué),2010,25(6):641-644.

[6]吳闖.α-細(xì)辛腦的研究進(jìn)展[J].中國藥學(xué)雜志,1997,32(3):129.

[7]趙李宏,吳建梅,武鳳蘭.近十年來α-細(xì)辛腦的研究進(jìn)展[J].中國中藥雜志,2007,32(7):562-565.

[8]馬雯芳,余嬌,鄧慧連,等.不同干燥方法對假蒟揮發(fā)油成分影響的研究[J].中成藥,2013,35(6):1270-1274.

[9]馬雯芳,余嬌,蔡毅,等.HPLC測定假蒟中的α-細(xì)辛腦及其含量的動態(tài)積累[J].華西藥學(xué)雜志,2013,28(3):293-295.

[10]蔡毅,馬雯芳,余嬌,等.廣西產(chǎn)假蒟HPLC指紋圖譜的研究[J].華西藥學(xué)雜志,2013,28(5):548-549.

StudyonQualityStandardforZhuangMedicineofPiperSarmentosumRoxb

GUI Zhen-cai1YAN Ping-hua2TANG Yu-rong2GAN Ri-cheng2

1.Pharmacy of the First Affiliated of Guangxi University of Chinese Medicine,Guangxi Province, Nanning 530023, China;2. Guangxi University of Chinese Medicine, Guangxi Province, Nanning 530001, China

ObjectiveStudy on the Quality Standard of Piper sarmentosum Roxb.MethodsIdentification of Piper sarmentosumRoxb.by four classic identification methods, and content of moisture, total ash, acid-insoluble ash and water extract were determined according to the approaches listed in the Chinese pharmacopoeia published in 2010, the content of α-asarone and fingerprint of Piper sarmentosum Roxb. were establish by HPLC.ResultsDetermined the identification,content determination and fingerprint methods for Piper sarmentosum Roxb..ConclusionThe methods provide experimental basis for the quality standard of Piper sarmentosum Roxb.

Piper sarmentosum Roxb.; identification; determination; fingerprint; quality standard

廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科技專項課題(GZKZ10-034),《廣西壯族自治區(qū)壯藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(第二卷)》標(biāo)準(zhǔn)研究項目(MZY2010072)。

桂貞才(1963-)，男，廣西扶綏人，主要從事中藥品種、品質(zhì)及資源開發(fā)研究。

R29

A

1007-8517(2014)16-0021-04

2014.06.05)