核因子IA在神經(jīng)角質(zhì)細(xì)胞瘤中的表達(dá)及與患者生存的關(guān)系

姜洪剛，寧桂蘭，鄭景輝 (.廣西梧州市桂東人民醫(yī)院神經(jīng)外科，廣西 桂東 54300;.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西 5300)

膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，占人類所有原發(fā)性顱內(nèi)新生物的40% ～50%［1］。在各年齡組的發(fā)病率和死亡率都很高，但是對(duì)其預(yù)后的研究仍然較少［2～4］。傳統(tǒng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤，依靠細(xì)胞形態(tài)學(xué)或細(xì)胞培養(yǎng)來分類［5］。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)的分類系統(tǒng)，神經(jīng)膠質(zhì)瘤可細(xì)分為星形細(xì)胞瘤，少突膠質(zhì)細(xì)胞，或混合少突膠質(zhì)細(xì)胞等。專一位點(diǎn)DNA結(jié)合蛋白(也被稱為CTF或CATT box轉(zhuǎn)錄因子)的核因子I(NFI)家族在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育中具有關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用［6－7］。NFIA是NFI值家族的成員之一，在鼠類和鳥類心室發(fā)育中具有關(guān)鍵的作用已經(jīng)被證明。并且已知NFI基因在大鼠的腦和脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞分化中具有關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用，其機(jī)制可能是通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控的膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)的表達(dá)來發(fā)揮作用［8］。此外，在出生后的小鼠大腦中切除NFIA或NFIB，中線的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞群就會(huì)產(chǎn)生發(fā)育缺陷［9］。事實(shí)上，NFIA在人胎兒前腦的中線結(jié)構(gòu)中也表達(dá)［10］。NFI基因在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育過程中，表現(xiàn)出動(dòng)態(tài)的表達(dá)方式［11］。在胚胎角質(zhì)的發(fā)生過程中，NFI基因的表達(dá)在所有膠質(zhì)前體的發(fā)展過程中，他們?cè)谏偻荒z質(zhì)細(xì)胞系中發(fā)生轉(zhuǎn)錄抑制，他們的表達(dá)維持了星形膠質(zhì)細(xì)胞的特征。這樣的模式，有可能被用來識(shí)別存在沿軸線不同點(diǎn)分化的細(xì)胞。此外，NFIA參與神經(jīng)膠質(zhì)發(fā)展的事實(shí)表明，它可能會(huì)在神經(jīng)膠質(zhì)腫瘤發(fā)生改變，甚至可能在腦膠質(zhì)瘤發(fā)展中發(fā)揮重要作用。因此，我們檢測(cè)可能在膠質(zhì)瘤中發(fā)揮作用的NFIA，我們分析了神經(jīng)膠質(zhì)腫瘤的NFIA在表達(dá)及其與患者的生存之間的關(guān)系。我們的數(shù)據(jù)顯示，高表達(dá)NFIA蛋白的星形細(xì)胞瘤患者其生存期較長(zhǎng)，表明NFIA在人腦星形細(xì)胞瘤的生物學(xué)活動(dòng)中可能發(fā)重要作用。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本：這項(xiàng)回顧性研究分析了從2007年～2012年間在我院的116例患者病理標(biāo)本。病理審查后，8例保存不當(dāng)?shù)哪[瘤材料被剔除在外。余下的108例可利用組織樣本包括82例人腦膠質(zhì)瘤(61例星形細(xì)胞瘤，17例少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤，以及4例少突－星形細(xì)胞瘤)，16例非角質(zhì)細(xì)胞腫瘤(聽神經(jīng)瘤、腦膜瘤，神經(jīng)鞘瘤，淋巴瘤，每組4例)，和10例從癲癇外科手術(shù)或尸體解剖切除非腫瘤性腦組織。其中高級(jí)別星形細(xì)胞瘤25例兒科患者。

1.2 免疫組織化學(xué)染色：使用免疫組化染色的方法檢查NFIA的表達(dá)，使用NFIA和GFAP雙標(biāo)記免疫組織化學(xué)方法進(jìn)行。對(duì)標(biāo)本進(jìn)行石蠟包埋，脫石蠟后，熱抗原修復(fù)20 min，使用以下抗體：NFIA1：3 000(兔多克隆抗體，)和 GFAP1：50(小鼠單克隆的 IgG1，DAKO)。NFIA多克隆抗體是針對(duì)人NFIA 478－492氨基酸的。一抗使用兔IgG作為陰性對(duì)照。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序，進(jìn)行蘇木精和曙紅(HE)染色。

1.3 免疫組織化學(xué)染色分析：使用Image Pro Plus6.0軟件，由同一病理學(xué)科醫(yī)生獨(dú)立進(jìn)行盲法分析，按照WHO的診斷分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)樣品先進(jìn)行病理診斷。NFIA表達(dá)的量化分析由2個(gè)研究者獨(dú)立進(jìn)行分析。通過計(jì)算切片視野中NFIA陽細(xì)胞的數(shù)量占總細(xì)胞數(shù)另估比值來確定NFIA的定量表達(dá)。(視野倍率×400，每個(gè)切片3個(gè)視野，至少包含200腫瘤細(xì)胞)。NFIA染色細(xì)胞作為NFIA－表達(dá)細(xì)胞。由于內(nèi)皮細(xì)胞缺乏NFIA免疫反應(yīng)性被用來作為內(nèi)部背景陰性對(duì)照。兩個(gè)分析者讀數(shù)的平均值用于統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 PFS：PFS定義為自診斷之日起，最小時(shí)間間隔的日期腫瘤的復(fù)發(fā)，進(jìn)展或最后的隨訪。

1.5 數(shù)據(jù)分析：患者的生存分析采用(Kaplan－Meier)方法，NFIA的表達(dá)各組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，使用SPSS16.0進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 NFIA的在正常大腦星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)：我們采用免疫組化的方法分析正常腦組織表達(dá)，確定是否正常人類的星形膠質(zhì)細(xì)胞中也有表達(dá)NFIA。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NFIA在正常的人大腦皮層表達(dá)較多(圖1－A)，而在白質(zhì)中表達(dá)較少(圖1－B)。值得注意的是，NFIA染色的細(xì)胞表現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的特征，與少突膠質(zhì)細(xì)胞比較，具有較大的胞核和豐富的胞漿，NFIA和GFAP的雙染細(xì)胞(分化的星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記)顯示在正常的大腦皮層，NFIA是主要表達(dá)在GFAP陽性細(xì)胞上(圖1－C)。這些數(shù)據(jù)表明，在正常的人類大腦皮層，NFIA主要表達(dá)在細(xì)胞星形膠質(zhì)細(xì)胞譜系。

圖1 A大腦皮層，B白質(zhì)C NFIA(褐色)和GFAP(猩紅色)雙染在星形膠質(zhì)細(xì)胞(×400)

2.2 NFIA在膠質(zhì)細(xì)胞瘤中的表達(dá)：在胚胎發(fā)育過程中，NFIA主要表現(xiàn)在星形膠質(zhì)細(xì)胞系的細(xì)胞，但少量表達(dá)在少突膠質(zhì)細(xì)胞系。因此，比較NFIA在非星形膠質(zhì)瘤中的表達(dá)：61例星形膠質(zhì)細(xì)胞和16例少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤和16例非角質(zhì)細(xì)胞作比較。我們發(fā)現(xiàn)只有具有星形膠質(zhì)細(xì)胞特征的細(xì)胞高表達(dá)NFIA(圖2－A)。反之，少突膠質(zhì)細(xì)胞不表達(dá)NF1A的(圖2－B)。NFIA在少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞的定量分析表明，平均只有7.25%表達(dá)NFIA(。其表達(dá)顯著低于星形細(xì)胞瘤的表達(dá)(P＜0.01，表1)。同樣，在我們觀察的非角質(zhì)腦腫瘤(神經(jīng)鞘瘤，淋巴瘤和腦膜瘤，共4例其他類型的腫瘤)，NFIA也有3%左右的腫瘤細(xì)胞表達(dá)(圖2－C)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，雖然NFIA在星形細(xì)胞瘤中高表達(dá)，它是在少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤和在非角質(zhì)腦瘤中也有少量表達(dá)。

2.3 NFIA在惡性星形細(xì)胞瘤中的表達(dá)與PFS的關(guān)系：我們進(jìn)一步將NFIA的表達(dá)按高低分為相等的三個(gè)組，根據(jù)患者PFS做了生存分析，結(jié)果顯示三組的中位生存時(shí)間分別是69、41、44個(gè)月，P=0.036＜0.05。NFIA高表達(dá)組生存率較高與PFS明顯的呈單變量復(fù)相關(guān)(圖3)。

表1 NFIA在各種細(xì)胞中的表達(dá)

圖2 NFIA在各種細(xì)胞中的表達(dá)(×400)

圖3 NFIA在惡性星形細(xì)胞瘤中的表達(dá)與PFS的關(guān)系生存率曲線圖

3 討論

NFIA是一種在小鼠和鳥類的胚胎發(fā)育過程中早表達(dá)、決定星形膠質(zhì)細(xì)胞的命運(yùn)的轉(zhuǎn)錄因子。本次研究的目的是評(píng)價(jià)角質(zhì)細(xì)胞命運(yùn)的決定因素NFIA在人類神經(jīng)角質(zhì)細(xì)胞瘤與一般腦腫瘤和非神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤中的表達(dá)。盡管我們的數(shù)據(jù)提示NFIA參與星形角質(zhì)細(xì)胞的生物學(xué)過程，但是其機(jī)制尚未明確。因?yàn)镹FIA是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞胚胎發(fā)育過程中必須的。這是一個(gè)基于遺傳和細(xì)胞背景的復(fù)雜作用機(jī)制，NFIA的表達(dá)的具體作用體現(xiàn)在不同的亞型［12－13］。值得注意的是在雞的胚胎成纖維細(xì)胞NFIA是不致癌的，并且它的表達(dá)有助于細(xì)胞抗致癌基因引起的細(xì)胞分化。比如說jun，fos和myc基因(所有編碼轉(zhuǎn)錄的因子)［14］，再次說明了其抗癌的作用。但是這些表達(dá)NFIA的雞細(xì)胞又容易在胞質(zhì)中致癌基因作用下分化如src，raf，ras基因，說明它通過不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路扮演著不同角色。發(fā)生以上情況的原因可能是很多亞型的不同作用，正如WT1一樣最初是在腫瘤抑制基因中發(fā)現(xiàn)，但是在另一個(gè)亞型里面，后來發(fā)現(xiàn)又具有促癌作用［15－16］。另外遺傳背景也能發(fā)揮重要作用，在確定抗癌/促癌功能方面，這些已得到證明，如myc和ras甚因，它們p53表達(dá)時(shí)候誘發(fā)凋亡，當(dāng)p53缺失促進(jìn)轉(zhuǎn)化［17－19］。NFI能在p53啟動(dòng)子位置聯(lián)合啟動(dòng)p53基本功能的一種鋅指蛋白，他能促進(jìn)如c－myc或抑制如c－fos等其他啟動(dòng)子［20］。

尋找從少突膠質(zhì)細(xì)胞腫瘤區(qū)分星形細(xì)胞瘤的標(biāo)記，長(zhǎng)期以來一直是神經(jīng)病理學(xué)家和神經(jīng)腫瘤學(xué)家的目標(biāo)。然而，如Olig2和STAT3，這被認(rèn)為是作用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤的形成的標(biāo)記，都同樣表達(dá)在星形細(xì)胞瘤和少突膠質(zhì)細(xì)胞，限定了他們的診斷價(jià)值［21－22］。因此，我們的觀察NFIA表達(dá)在所有級(jí)別的星形細(xì)胞瘤，但只有少量表達(dá)在少突角質(zhì)細(xì)胞瘤，并估計(jì)未來的研究可能會(huì)發(fā)現(xiàn)NFIA是一個(gè)區(qū)分這兩個(gè)神經(jīng)膠質(zhì)腫瘤有用的診斷標(biāo)記。

支持上述說法，少量的少突膠質(zhì)細(xì)胞腫瘤的初步檢查顯示，細(xì)胞NFIA的表達(dá)和少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記的細(xì)胞表達(dá)，Olig2是相互排斥的(數(shù)據(jù)未顯示，未發(fā)表的數(shù)據(jù))。NFIA是優(yōu)先表達(dá)在星形膠質(zhì)細(xì)胞，少突膠質(zhì)細(xì)胞與發(fā)育階段的表達(dá)模式，這些數(shù)據(jù)是一致的。有趣的是，在脊髓發(fā)育的某些階段，Olig2對(duì)抗NFIA促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的分化，并且NFIA對(duì)Olig2的抑制似乎依賴于兩種蛋白的相對(duì)水平。另外，Olig2可以轉(zhuǎn)錄抑制NFIA表達(dá)。在Olig2 2/2小鼠，有一個(gè)脫抑制NFIA表達(dá)，這表明在少突膠質(zhì)細(xì)胞Olig2可能轉(zhuǎn)錄抑制NFIA表達(dá)的。當(dāng)然還需要更全面的研究，以確定是否NFIA可能是有用的診斷星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記，以區(qū)分腦星形細(xì)胞瘤，少突膠質(zhì)細(xì)胞腫瘤的情況下，尤其是形態(tài)學(xué)很難評(píng)估的時(shí)侯。

我們證明NFIA在星形細(xì)胞瘤中的蛋白表達(dá)與更長(zhǎng)的PFS顯著相關(guān)，盡管這是一個(gè)相對(duì)較小樣本的分析。較大規(guī)模的多中心研究將可以確定是否NFIA可能是一個(gè)潛在的星形細(xì)胞瘤的預(yù)后指標(biāo)。Scrideli等通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)20例GBM NFIA mRNA的表達(dá)高于10個(gè)非腫瘤性樣品白質(zhì)超過13倍，遺憾的是但沒有檢查其與PFS或OS的關(guān)系。

我們的免疫組織化學(xué)結(jié)果表明，GBM的細(xì)胞表達(dá)NFIA在分?jǐn)?shù)是高于在正常腦組織，Scrideli等在蛋白質(zhì)水平證實(shí)了NFIA在雞胚成纖維細(xì)胞中的表達(dá)，使它們能夠抵抗核內(nèi)癌基因的激活，這個(gè)結(jié)果可能暗示我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果的相關(guān)機(jī)制。NFIA在雞胚成纖維細(xì)胞的保護(hù)作用說明其可以保護(hù)細(xì)胞免受進(jìn)一步轉(zhuǎn)變事件。然而它的損失是暴露細(xì)胞使其惡性變的可能性增加?？傊覀兊臄?shù)據(jù)表明，星形細(xì)胞瘤NFIA蛋白的表達(dá)改善 PFS有明確的關(guān)系。這也支持 REMBRANDT GBM芯片分析數(shù)據(jù)庫(kù)。這些發(fā)現(xiàn)，與現(xiàn)有的知識(shí)相結(jié)合，表明NFIA可能在星形細(xì)胞瘤生物學(xué)中具有重要的作用。

同時(shí)值得注意的是我們發(fā)現(xiàn)在GBM中與非血管周圍腫瘤細(xì)胞相化NFIA蛋白是高度濃縮在血管周圍的腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)性腫瘤邊界，這提示我們?cè)谛切文z質(zhì)細(xì)胞瘤中，NFIA參與(或促進(jìn)或抑制)腫瘤細(xì)胞做浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。與此同時(shí)，黏附分子ephrin B1和鈣粘蛋白也被證實(shí)是NFIA的目標(biāo)［23］。這值得進(jìn)一步深入研究。

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