牛奶中體細(xì)胞數(shù)快速檢測方法探討

田 歌，梁茂文，楊繼業(yè)

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山西太原030032；2.山西省畜牧獸醫(yī)遺傳育種中心，山西太原030000）

乳制品是一種營養(yǎng)豐富的食品，能滿足人體的多種營養(yǎng)需求。世界上很多國家都特別重視乳制品生產(chǎn)的發(fā)展[1-2]。目前，隨著我國人民生活水平的不斷提高，對乳制品的需求也不斷上升，有力地促進(jìn)了國內(nèi)乳業(yè)的快速發(fā)展。但是與國外發(fā)達(dá)國家相比，國內(nèi)的乳制品在產(chǎn)品品質(zhì)和加工技術(shù)上均有較大的差距，其中一個很重要的原因是原料奶的品質(zhì)難以得到保證[3-6]。鮮奶的質(zhì)量直接決定了乳制品的質(zhì)量，影響著國內(nèi)乳制品行業(yè)的發(fā)展。牛奶中的體細(xì)胞數(shù)是反映鮮牛奶品質(zhì)的一個重要指標(biāo)，很多乳業(yè)發(fā)達(dá)國家都把它作為判斷牛奶品質(zhì)的一個重要指標(biāo)，依此制定牛奶收購標(biāo)準(zhǔn)。我國也把牛奶體細(xì)胞數(shù)指標(biāo)作為衡量原料奶質(zhì)量指標(biāo)之一。

1 牛奶體細(xì)胞

牛奶中的體細(xì)胞有2個來源，一是來自乳腺分泌組織中的上皮細(xì)胞（也稱腺細(xì)胞）；二是來自與炎癥進(jìn)行搏斗時而死亡的白細(xì)胞。腺細(xì)胞是正常的體細(xì)胞，是乳腺進(jìn)行新陳代謝過程的產(chǎn)物，在奶中的含量相對恒定。而白細(xì)胞是一種防衛(wèi)細(xì)胞，可殺滅導(dǎo)致乳腺炎的病菌，還可以修復(fù)損傷的組織[7]。因此，白細(xì)胞在牛奶中的數(shù)量隨奶牛的生理狀態(tài)和健康水平有很大變化。引起牛奶體細(xì)胞數(shù)增加的因素有多個，其中一個主要因素是傳染性乳房炎的病菌，這些病菌主要包括金色葡萄球菌、乳鏈球菌、大腸西氏桿菌等[8]。通常奶牛乳房出現(xiàn)炎癥或者外傷時，機(jī)體會分泌大量白細(xì)胞以清除感染。牛奶中的體細(xì)胞數(shù)很大程度上反映了奶牛的健康狀況和牛奶的品質(zhì)。牛奶中正常的體細(xì)胞數(shù)為20萬個/mL（標(biāo)準(zhǔn)），但初產(chǎn)母牛和管理良好的牛群可能低于10萬個/mL，如果體細(xì)胞數(shù)超過25萬～30萬個/mL，就說明有細(xì)菌感染。

2 牛奶體細(xì)胞數(shù)直接檢測法

2.1 顯微鏡直接計(jì)數(shù)法

顯微鏡直接計(jì)數(shù)法是將小量待測樣品的懸浮液置于一種特別的具有確定面積和容積的載玻片上（又稱計(jì)菌器），于顯微鏡下直接計(jì)數(shù)的一種簡便、快速、直觀的方法。該方法將一定量的鮮牛奶注射到一個面積為5 mm×20 mm的載玻片上，并置于37℃的恒溫箱中，水平放置5 min左右，形成厚度均勻的牛奶樣模，然后用亞甲基藍(lán)染色15 min左右，最后取出晾干，可以在顯微鏡下對白細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。該方法是牛奶體細(xì)胞數(shù)檢測的基準(zhǔn)方法，需要的儀器設(shè)備很少，缺點(diǎn)是檢測耗時比較長，而且使用的試劑如四氯乙烷有較強(qiáng)的毒性，因此，該方法在實(shí)際中應(yīng)用比較少[9]。

2.2 高速體細(xì)胞計(jì)數(shù)法

比較有代表性的是用丹麥福斯公司研制的FossoMatic5000系列儀器對體細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)[10]。該方法的工作原理是讓被染色的體細(xì)胞通過一個被設(shè)計(jì)的非常狹窄的流路系統(tǒng)，每次只能有一個被染色的體細(xì)胞通過，然后對體細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。通過對體細(xì)胞進(jìn)行DNA分子染色，染色后的體細(xì)胞就十分便于觀察了。具體做法：讓牛奶樣品在觀察室里暴露出藍(lán)光，藍(lán)光會激發(fā)熒光染色，最后體細(xì)胞就呈現(xiàn)紅光，將這些紅光放大就可以被光脈沖計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。在檢測前需要將牛奶樣品預(yù)熱到37～42℃，并攪拌均勻，吸取0.2 mL的樣品與加熱后的緩沖液、染液進(jìn)行混合，最后放入儀器進(jìn)行測定。該方法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡單、速度快、重復(fù)性好，可集中測定大量的樣品[11]。

3 牛奶體細(xì)胞數(shù)間接檢測法

3.1 CMT試驗(yàn)法

CMT試驗(yàn)法是加利福尼亞細(xì)胞數(shù)測定法（California Mastitis Test）的簡稱，是由 Noorlander和Scalm于1957年首創(chuàng)的一種化學(xué)檢測方法。該檢測方法的基本原理是：用表面活性劑烷基丙烯基磺（硫）酸鹽使乳汁中各種白細(xì)胞膨脹變性，苛性鈉（NaOH）加速細(xì)胞電荷的改變。這樣，在白細(xì)胞之間的間隙及其電荷發(fā)生改變的情況下，變性細(xì)胞彼此之間會出現(xiàn)凝結(jié)。通過凝結(jié)程度，近似判斷出乳汁中體細(xì)胞含量，進(jìn)而了解該乳區(qū)的乳房炎有無及嚴(yán)重程度。該檢測方法需要CMT診斷液試劑和1個診斷托盤，即1個帶有手柄的方形塑料托盤，上有4個圓形小室，直徑為5 cm，深為1.5 cm。進(jìn)行檢測時，將被檢牛4個乳區(qū)的乳汁分別擠入4個小室中，約2 mL，再向小室中各加入2 mL的CMT診斷液，然后呈同心圓搖動診斷盤，反應(yīng)1 min后，即可進(jìn)行結(jié)果判定。該方法簡單易行，在牛旁就能進(jìn)行，實(shí)用性較高。由于對檢測結(jié)果的判定具有主觀性，所以，不同檢測者的結(jié)果難免會有差異[12]。

3.2 4%NaOH溶液檢測法

該方法是在置于黑色背景的載玻片上，滴加被檢奶汁（鮮牛奶或者冷藏2 d以內(nèi)的牛奶）5滴，再加入4%的NaOH溶液2滴，攪拌均勻后進(jìn)行判定，其判定標(biāo)準(zhǔn)列于表1。

表1 判定標(biāo)準(zhǔn)

該方法簡單易操作、成本低，但檢測結(jié)果不準(zhǔn)確，易受多種因素的影響。

3.3 pH值檢測法

乳房發(fā)炎奶牛的乳汁pH值與體細(xì)胞之間有著一定的關(guān)聯(lián)性，可以通過測定乳汁的pH值來判斷體細(xì)胞的數(shù)量。具體檢測方法：先用一次性培養(yǎng)皿取乳樣大約2 mL，然后在里面滴加等量的診斷液，以同心圓方式搖動培養(yǎng)皿，在30～60 s之間可以對結(jié)果進(jìn)行判斷。測定的pH值結(jié)果按如下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判別：pH值在6.4～6.6之間，體細(xì)胞數(shù)為0～20萬個/mL；pH值為6.6～6.8，體細(xì)胞數(shù)為20萬～50萬個/mL；pH值為6.8～7.0，體細(xì)胞數(shù)為50萬～150萬個/mL；pH值為7.0～7.2，體細(xì)胞數(shù)為150萬～500萬個/mL；pH值在7.2以上，體細(xì)胞個數(shù)達(dá)到500萬個/mL以上[13-15]。該方法簡單易操作，但是結(jié)果可能不太準(zhǔn)確，有時需要進(jìn)一步通過顯微鏡檢測才能得到較準(zhǔn)確的結(jié)論。因此，目前我國普遍采用高速體細(xì)胞計(jì)數(shù)法。

對牛奶體細(xì)胞數(shù)的檢測不僅可以用來檢測牛奶的品質(zhì)，還可以用來對奶牛的乳腺炎等進(jìn)行監(jiān)測，有著重要的實(shí)用價值。在現(xiàn)實(shí)操作中，可以根據(jù)不同的需求選擇不同的體細(xì)胞檢測方法[16]。

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