潰瘍性結(jié)腸炎患者結(jié)腸黏膜干擾素-γ、occludin和閉鎖小帶蛋白-1表達及其相關(guān)性研究

張續(xù)乾 來培培 董 魁 方維麗 李海東 劉文天*

天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院消化科1(300052) 天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院2

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)是一種慢性非特異性結(jié)直腸炎癥病變。近15年來，UC發(fā)病率在我國呈持續(xù)上升趨勢[1]。然而，目前UC的病因和發(fā)病機制尚未完全闡明，已成為一個亟待解決的難題。已有研究證實，炎癥性腸病(IBD)患者血清促炎細胞因子水平較正常人群顯著升高，能導(dǎo)致不同程度的腸上皮緊密連接結(jié)構(gòu)破壞[2]。本研究通過檢測UC患者結(jié)腸黏膜促炎細胞因子干擾素-γ(IFN-γ)和緊密連接蛋白occludin、閉鎖小帶蛋白-1(zonula occluden-1， ZO-1)的表達情況以及其間的相關(guān)性，為明確UC的發(fā)病機制提供線索。

材料與方法

一、標本來源

納入2011年1月-2011年7月在天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院就診的UC患者。UC診斷標準參考“對我國炎癥性腸病診斷治療規(guī)范的共識意見”[3]。選取20名同時期健康體檢者(結(jié)腸鏡檢查未見結(jié)直腸黏膜病變)作為正常對照組。UC組患者入組前2周內(nèi)未服用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑，正常對照組近1個月內(nèi)無胃腸道疾病以及服用相關(guān)藥物史。所有受檢者于結(jié)腸鏡下取結(jié)腸黏膜組織標本。研究方案經(jīng)天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院倫理委員會批準，入組者均簽屬知情同意書。

二、研究方法

1. 免疫組化染色檢測結(jié)腸黏膜組織IFN-γ、occludin、ZO-1蛋白的表達和分布：結(jié)腸黏膜組織經(jīng)石蠟包埋后，4 μm連續(xù)切片、烤片，常規(guī)二甲苯脫蠟，3% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，高溫高壓抗原修復(fù)，非免疫血清封閉。分別加入兔抗人IFN-γ多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)、兔抗人occludin、ZO-1多克隆抗體(英國Abcam公司)(滴度均為1∶100)，4 ℃孵育過夜，加入生物素標記的羊抗兔IgG，37 ℃孵育20 min，加入SABC試劑(武漢博士德生物工程有限公司)，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，樹膠封片。以PBS代替一抗作為陰性對照。

結(jié)果判斷：光學(xué)顯微鏡下出現(xiàn)黃色顆粒狀染色的細胞判定為免疫組化染色陽性細胞。每張切片在高倍鏡下計數(shù)10個視野，每組計數(shù)不少于1 000個細胞，參照Shimizu等[4]采用的方法，依據(jù)染色陽性細胞占細胞總數(shù)的百分率和染色強度進行評分。陽性細胞比例評分：0分，<5%；1分，5%～25%；2分，25%～50%；3分，50%～75%；4分，>75%。陽性細胞染色強度評分：0分，無染色；1分，淡黃色；2分，棕黃色；3分，棕褐色?？偡譃殛栃约毎壤u分與陽性細胞染色強度評分之和：0分，(-)；1～2分，(+)；3～5 分，(++)；6～7分，(+++)。

2. 實時熒光定量PCR檢測結(jié)腸黏膜occludin、ZO-1 mRNA表達：①取結(jié)腸黏膜組織，采用DNA/RNA共提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取總RNA。②逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA：采用TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix反應(yīng)體系(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，引物由廣州市銳博生物科技有限公司設(shè)計合成。③實時熒光定量PCR：采用TransStart Green qPCR SuperMix反應(yīng)體系(北京全式金生物技術(shù)有限公司)和ABI 7500 Real-time PCR儀，引物由廣州市銳博生物科技有限公司設(shè)計合成。Occludin上游引物：5’-GGG ACA AGG AAC ACA TTT ATG AT-3’，下游引物：5’-TGG ATT TAT AGG AAG ACT CTG GAT-3’；ZO-1上游引物：5’-GCG GTC AGA GCC TTC TGA TC-3’，下游引物：5’-CAT GCT TTA CAG GAG TTG AGA CAG-3’。所得結(jié)果以2-△△Ct法分析。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、一般情況

共納入40例UC患者，其中男23例，女17例，平均年齡(46.80±16.76)歲，UC緩解期12例，活動期28例，其中輕度活動期9例，中度活動期13例，重度活動期6例。正常對照組20名，其中男12名，女8名，平均年齡(42.60±8.13)歲。兩組間性別構(gòu)成、年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

二、結(jié)腸黏膜IFN-γ蛋白表達情況

IFN-γ染色陽性物質(zhì)位于細胞質(zhì)，主要表達于中性粒細胞、單核細胞等，多集中于靠近黏膜肌層的黏膜固有層內(nèi)，黏膜上皮細胞有少量表達。UC組結(jié)腸黏膜上皮和間質(zhì)內(nèi)均可見明顯INF-γ表達，而正常對照組僅有少量或無IFN-γ表達(圖1)。UC組IFN-γ蛋白表達較正常對照組顯著升高(χ2=20.470,P=0.000)，且活動期顯著高于緩解期(χ2=18.936,P=0.004)(表1)。進一步按UC不同疾病活動期進行比較，UC重度活動期IFN-γ免疫組化染色評分均數(shù)較輕、中度活動期和緩解期顯著升高(F=5.977,P=0.002)，輕、中度活動期和緩解期組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=2.075,P=0.121)(表2)。

三、結(jié)腸黏膜occludin、ZO-1蛋白表達情況

Occludin、ZO-1染色陽性物質(zhì)位于細胞質(zhì)，主要表達于腸上皮細胞。UC組結(jié)腸黏膜occludin、ZO-1蛋白表達較正常對照組顯著降低(χ2=7.790，P=0.020；χ2=17.691，P=0.000)(圖2、表3)，UC活動期與緩解期組間、不同疾病活動期組間occludin、ZO-1蛋白表達差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.945，P=0.551；χ2=5.291，P=0.507)(表3、表4)。

四、結(jié)腸黏膜occludin、ZO-1 mRNA表達情況

UC組結(jié)腸黏膜occludin、ZO-1 mRNA表達顯著低于正常對照組(Z=3.599，P=0.000；Z=3.826，P=0.000)(表5)，UC不同疾病活動期組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.928，P=0.437；F=0.435，P=0.729)(表6)。

A：UC組結(jié)腸黏膜上皮和間質(zhì)內(nèi)均可見明顯IFN-γ表達；B：正常對照組結(jié)腸黏膜僅有少量或無IFN-γ表達

表1 正常對照組與UC組結(jié)腸黏膜IFN-γ蛋白表達比較 n(%)

表2 UC不同疾病活動期IFN-γ蛋白表達比較

表3 正常對照組與UC組結(jié)腸黏膜occludin、ZO-1蛋白表達比較n(%)

表4 UC不同疾病活動期occludin、ZO-1蛋白表達比較n(%)

表5 正常對照組與UC組結(jié)腸黏膜occludin、ZO-1 mRNA表達比較

表6 UC不同疾病活動期occludin、ZO-1 mRNA表達比較

五、IFN-γ與occludin、ZO-1的相關(guān)性分析

Spearman等級相關(guān)分析結(jié)果顯示，IFN-γ蛋白表達與occludin蛋白表達呈負相關(guān)(rs=-0.794，P=0.000)，與ZO-1蛋白表達亦呈負相關(guān)(rs=-0.820，P=0.000)。

討 論

UC是消化系統(tǒng)常見疾病和慢性腹瀉的主要病因，主要表現(xiàn)為腹瀉、腹痛、黏液膿血便，病情輕重不一，且可發(fā)生嚴重的局部和遠處并發(fā)癥，治愈難度相當(dāng)大，被世界衛(wèi)生組織列為現(xiàn)代難治病之一。

研究證實，IFN-γ作為一種重要的促炎因子，單獨或與其他促炎因子共同作用時，可引起腸黏膜屏障損傷，進而導(dǎo)致IBD發(fā)生[5-7]。Gassler等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，在IBD活動性炎癥組織中，緊密連接蛋白及其mRNA表達均顯著下降。對腸黏膜屏障功能相關(guān)基因的研究發(fā)現(xiàn)，UC腸黏膜屏障功能相關(guān)基因表達異常導(dǎo)致其編碼蛋白表達下降，可能在UC發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用[9-10]，緊密連接蛋白相關(guān)基因表達異常可通過影響連接復(fù)合體構(gòu)成、調(diào)控黏蛋白、水通道蛋白表達而影響腸黏膜通透性[11-14]。本研究檢測了UC患者的結(jié)腸黏膜促炎細胞因子IFN-γ和緊密連接蛋白occludin、ZO-1表達，發(fā)現(xiàn)UC患者結(jié)腸黏膜中的IFN-γ蛋白表達較正常對照組顯著升高，進一步作不同疾病活動期組間比較，重度活動期UC患者IFN-γ蛋白表達顯著高于輕、中度活動期和緩解期患者，但輕、中度活動期和緩解期患者間無明顯差異，表明IFN-γ與UC的發(fā)病機制有關(guān)，與疾病活動度之間亦存在一定相關(guān)性。Occludin、ZO-1 蛋白及其mRNA在UC組中的表達較正常對照組顯著降低，但在不同疾病活動期組間無明顯差異，表明occludin、ZO-1與UC的發(fā)病機制有關(guān)，但與疾病活動度可能無關(guān)。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)IFN-γ蛋白表達與occludin、ZO-1蛋白表達均呈負相關(guān)。上述結(jié)果提示，IFN-γ可能通過下調(diào)occludin、ZO-1表達，引起腸黏膜屏障功能損害，導(dǎo)致腸黏膜通透性增加，從而參與UC的發(fā)生。Utech等[15]的研究發(fā)現(xiàn)，以IFN-γ處理T84腸上皮細胞36 h，可促進Rho相關(guān)激酶(ROCK)編碼基因表達，進而激活Rho，導(dǎo)致肌球蛋白輕鏈激酶磷酸化，使肌球蛋白Ⅱ活化，引起頂層質(zhì)膜空泡化改變，最終導(dǎo)致緊密連接蛋白移位、降解。陳紅旗等[16]的研究發(fā)現(xiàn)，IL-10敲除小鼠存在腸屏障功能障礙，表現(xiàn)為促炎細胞因子腫瘤壞死因子(TNF)-α、IFN-γ濃度升高、腸上皮細胞間緊密連接超微結(jié)構(gòu)破壞、腸黏膜通透性增加，而給予益生菌干預(yù)能減輕腸道炎癥，降低TNF-α、IFN-γ濃度和腸黏膜通透性，促進緊密連接蛋白occludin、ZO-1表達。上述研究亦支持IFN-γ可能通過參與下調(diào)緊密連接蛋白表達而導(dǎo)致UC發(fā)生。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)UC患者結(jié)腸黏膜IFN-γ表達增高，同時緊密連接蛋白occludin、ZO-1表達降低，提示IFN-γ可能參與下調(diào)緊密連接蛋白表達，在UC發(fā)病中起有重要作用。然而，目前對IFN-γ通過何種途徑調(diào)節(jié)緊密連接蛋白表達及其相關(guān)分子機制尚無定論，需進一步深入研究，以闡明UC的發(fā)病機制，為其臨床治療提供理論依據(jù)。

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