宮內(nèi)暴露鄰苯二甲酸二酯對(duì)子代雌性成年大鼠心臟的影響

趙青松，方 瑞，吳 德，都鵬飛

宮內(nèi)暴露鄰苯二甲酸二酯對(duì)子代雌性成年大鼠心臟的影響

趙青松1，方 瑞2，吳 德1，都鵬飛2

目的 探討鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）宮內(nèi)暴露對(duì)子代雌性大鼠心臟的影響。方法 自妊娠第1天直至分娩，SD妊娠大鼠分別予以灌胃玉米油、低劑量［10 mg/（kg·d）］DEHP、高劑量［100 mg/（kg·d）］DEHP。觀察各組子代雌性大鼠一般狀況（體重）、心肌組織學(xué)以及心臟的血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)。結(jié)果 ①與正常對(duì)照組比較，DEHP染毒組雌性仔鼠自出生至生后70 d的體重增長(zhǎng)明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。② 高劑量組的心率（HR）、左室舒張壓（LVEDP）明顯高于正常對(duì)照組及低劑量組，而左室收縮壓（LVSP）、左室最大上升速率（+dp/dtmax）及左室最大下降速率（－dp/dtmax）明顯低于正常對(duì)照組及低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。③ 光鏡下高劑量組子代雌性大鼠的心肌細(xì)胞肥大，心肌纖維排列紊亂，大量心肌細(xì)胞核核固縮、深染;電鏡示大量心肌細(xì)胞核固縮、深染，心肌纖維排列紊亂、斷裂，線粒體嵴排列大部分?jǐn)嗔选⒛：?。然而，正常?duì)照組和低劑量組病理變化不明顯。結(jié)論 懷孕期間大劑量的DEHP接觸可引起子代雌性大鼠體重增加、血流動(dòng)力學(xué)異常和心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂。

鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯;胚胎期;心肌細(xì)胞;心功能

鄰苯二甲酸二（2-乙基己）酯［Di（2-ethylhexyl）phthalate，DEHP］是一種工業(yè)上添加到聚氯乙烯中使用最廣和產(chǎn)量最大的塑化劑，占全世界鄰苯二甲酸酯類消費(fèi)的80%［1］，在成品塑料中占據(jù)40%的比例。DEHP被廣泛應(yīng)用在食品包裝、玩具、化妝品和醫(yī)療制品等眾多領(lǐng)域，可通過皮膚接觸、消化道和呼吸道被吸收［2］，也可以通過胎盤屏障影響胎兒。DEHP作為一種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物（environmental endocrine disrupters，EEDs），其生殖毒性已經(jīng)得到研究者的公認(rèn)。但DEHP對(duì)心肌細(xì)胞及心臟功能的影響報(bào)道甚少。該研究主要通過胚胎期暴露于不同劑量的DEHP，觀察子代雌性大鼠心臟組織形態(tài)學(xué)及測(cè)定其血流動(dòng)力學(xué)，為今后DEHP心臟毒性的研究及干預(yù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 DEHP:分析純，純度98.6%（美國(guó)Sigma公司）;玉米油:市售，金龍魚牌;BL-420s生物機(jī)能試驗(yàn)系統(tǒng)、壓力換能器（成都泰盟科技有限責(zé)任公司）;Tecnai F20透射電子顯微鏡（中國(guó)科技大學(xué)集成影像中心）。

DEHP染毒溶液的配置:用移液管分別吸取1 ml DEHP，用玉米油分別稀釋100倍、10倍，顛倒混勻，配置成10、100 mg/ml的DEHP溶液。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及染毒方法 選擇健康成年清潔級(jí)SD大鼠9只，體重為220～250 g，雌 ∶雄為2∶1，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物可自由飲水、攝食，飼料由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物室溫度為18～23℃，相對(duì)濕度為45%～55%。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，將大鼠按雌雄2∶1進(jìn)行合攏后，以發(fā)現(xiàn)陰栓當(dāng)日為妊娠第1天，將孕鼠按體重隨機(jī)分為3組:正常對(duì)照組、低劑量（10 mg/kg）DEHP染毒組、高劑量（100 mg/kg）DEHP染毒組。根據(jù)大鼠生活習(xí)性，自妊娠第1天起，8∶00禁食，14∶00灌胃染毒DEHP，正常對(duì)照組予以玉米油灌胃，容量均為2 ml/kg，每天1次，直至孕鼠分娩當(dāng)日為止。給藥期間，每天稱重，根據(jù)體重調(diào)整給藥量。孕鼠產(chǎn)仔后，單獨(dú)一籠哺養(yǎng)同劑量染毒組子代雌性仔鼠。

1.3 血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定 子代雌性大鼠出生后3個(gè)月，稱體重，水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉，固定后，行氣管切開并給與人工機(jī)械通氣，予右頸總動(dòng)脈并插入充滿肝素0.9%氯化鈉溶液的導(dǎo)管，并外接BL-420s生物機(jī)能系統(tǒng)的換能器，觀察波形，將導(dǎo)管順勢(shì)推進(jìn)左心室，待波形穩(wěn)定，分別記錄心率（heart rate，HR）、左心室收縮壓（left ventricular systolic pressure，LVSP）、左心室舒張末壓（left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP）、左心室最大上升速率（maximal rise velocity of left ventricular pressure，+dp/dtmax）和左心室最大下降速率（maximal fall velocity of left ventricular pressure，－dp/dtmax）。

1.4 左心室心肌組織形態(tài)學(xué)觀察 記錄生后3個(gè)月的子代雌性大鼠的血流動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)后，迅速打開胸腔并取出心臟，取心尖部分放入10%福爾馬林固定、石蠟包埋，連續(xù)切片，片厚5 μm，常規(guī) HE染色等，光學(xué)顯微鏡下行組織形態(tài)學(xué)觀察。取左心室心肌組織，迅速投入3%戊二醛固定緩沖液中，預(yù)固定5～10 min待柔軟組織稍變硬后，用刀片快速切成1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊，然后室溫繼續(xù)固定2 h，電鏡標(biāo)本常規(guī)脫水、包埋，超薄切片（厚度為50～70 nm），透射電子顯微鏡觀察超微結(jié)構(gòu)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以±s表示，進(jìn)行成組t檢驗(yàn)和單因素方差分析（One-way ANOVA）。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 與正常對(duì)照組比較，DEHP染毒組仔鼠的一般行為無明顯改變。分別記錄子代雌性大鼠出生（d0）、生后21 d（d21）及生后70 d（d70）的體重，每組10只。與正常對(duì)照組比較，DEHP染毒組雌性仔鼠自出生至成年體重的增長(zhǎng)明顯，且隨DEHP劑量的增加，體重增長(zhǎng)越明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

2.2 血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較 3組子代成年SD雌性大鼠的左心室血流動(dòng)力學(xué)各指標(biāo)數(shù)值，見表2，高劑量組的HR、LVEDP明顯高于正常對(duì)照組及低劑量組（10 mg/kg），而 LVSP、+dp/dtmax及－dp/dtmax明顯低于正常對(duì)照組及低劑量組（10 mg/kg），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表1 子代雌性大鼠體重（g，n=10，±s）

表1 子代雌性大鼠體重（g，n=10，±s）

與正常對(duì)照組比較:*P＜0.05

時(shí)間 正常對(duì)照組 低劑量組 高劑量組 F值 P值d 0 6.438 ±0.36 7.003±0.494* 7.008±0.575*4.543 0.020 d 21 54.519 ±2.599 57.290 ±1.947* 59.468 ±3.630* 7.847 0.002 d 70 280.600 ±8.016 287.100±3.212 303.300±10.252*22.814 0.000

表2 左心室功能及血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)的比較（n=11，±s）

表2 左心室功能及血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)的比較（n=11，±s）

與正常對(duì)照組比較:*P＜0.05

項(xiàng)目 正常對(duì)照組 低劑量組 高劑量組 F值 P值HR（次/min） 370.82±13.97 373.45±3.47 407.64±12.38*38.571 0.000 LVSP（kPa） 18.86 ±0.70 19.30 ±0.65 15.04 ±0.37* 173.858 0.000 LVEDP（kPa） 0.89 ±0.22 0.80 ±0.21 2.28 ±0.29* 125.607 0.000+dp/dtmax（kPa）1 074.08 ±78.36 1 012.37 ±74.53 773.29 ±61.98* 53.589 0.000－dp/dtmax（kPa）－892.30±71.18－937.28±90.26－567.02±35.09*93.250 0.000

2.3 左心室心肌組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)

2.3.1 光鏡 宮內(nèi)暴露DEHP的子代成年雌性大鼠的心臟病理改變見圖1。正常對(duì)照組的雌性大鼠心肌纖維排列整齊，肌漿豐富，核呈現(xiàn)卵圓形，位居中央或一側(cè)。宮內(nèi)暴露不同劑量DEHP的成年雌性大鼠的心臟病變呈不同改變，見圖1A;低劑量（10 mg/kg）DEHP宮內(nèi)暴露的成年大鼠的心肌細(xì)胞基本同正常對(duì)照組心肌細(xì)胞大小，心肌細(xì)胞排列基本整齊，偶見、部分心肌細(xì)胞核固縮、深染，見圖1B;高劑量（100 mg/kg）DEHP宮內(nèi)暴露的成年雌性大鼠心肌細(xì)胞肥大，心肌纖維排列紊亂，大量心肌細(xì)胞核核固縮、深染，見圖1C。

圖1 宮內(nèi)暴露DEHP的子代成年雌性大鼠的心臟病理改變 ×100

2.3.2 電鏡 宮內(nèi)暴露不同劑量DEHP的子代成年雌性大鼠的心肌超微結(jié)構(gòu)改變見圖2。正常對(duì)照組子代雌性大鼠心肌細(xì)胞核染色質(zhì)分布均勻，肌原纖維橫紋清晰，心肌纖維排列正常，線粒體嵴排列清楚，見圖2A。宮內(nèi)暴露不同劑量DEHP的條件下，成年雌性大鼠的心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變程度不同，以高劑量DEHP引起的損傷較重;低劑量組大鼠心肌細(xì)胞核形不整（紅色箭頭所示），心肌纖維排列偶見紊亂（黑色箭頭所示），線粒體基質(zhì)嵴小部分?jǐn)嗔?、模糊，見圖2B;高劑量組大量心肌細(xì)胞核固縮、深染（紅色箭頭所示），心肌纖維排列紊亂、斷裂（黑色箭頭所示），線粒體嵴排列大部分?jǐn)嗔选⒛：?，見圖2C。

圖2 宮內(nèi)暴露不同劑量DEHP的子代成年雌性大鼠的心肌超微結(jié)構(gòu)改變

3 討論

DEHP為環(huán)境暴露水平最高的一種鄰苯二甲酸酯類化合物，作為塑化劑普遍存在日常生活（食品包裝、化妝品、玩具等）中，目前在醫(yī)療領(lǐng)域的應(yīng)用也越來越廣泛，如血袋、靜脈輸液袋、輸血器、腹膜透析袋、心肺分流術(shù)軟管、血液透析管等。尤其是新生兒加強(qiáng)監(jiān)護(hù)病房的患兒可以接觸到醫(yī)療設(shè)備中高濃度的DEHP。一般人群的DEHP暴露水平估計(jì)平均每天3～30 μg/kg體重（不包括職業(yè)暴露、各種醫(yī)療暴露及兒童非飲食攝入），主要來源于食品中DEHP的殘留［3］。孕婦和發(fā)育期兒童對(duì)DEHP更為敏感。

Aronson et al［4］研究發(fā)現(xiàn) DEHP 可影響大鼠心臟的電生理變化。2013年第1次發(fā)現(xiàn)宮內(nèi)暴露DEHP可影響子代雄性成年大鼠心血管功能，導(dǎo)致全身動(dòng)脈收縮壓、舒張壓及活性均降低［5］。但對(duì)于雌性大鼠的影響未見報(bào)道。

本研究顯示宮內(nèi)暴露DEHP的雌性仔鼠，其體重增長(zhǎng)與DEHP劑量相關(guān)，高劑量組（100 mg/kg）子代雌性成年鼠的體重增長(zhǎng)明顯，與正常對(duì)照組及低劑量組（10 mg/kg）有顯著性差異，其機(jī)制可能與DEHP在體內(nèi)被分解為單脂等價(jià)物鄰苯二甲酸單乙基己基酯（MEHP），MEHP激活過氧化物酶體增值物激活受體-γ（PPARγ），從而誘導(dǎo)脂肪形成［6］。普通飲食和含高脂肪的飲食并不會(huì)引起動(dòng)物肥胖［2］。這可能僅僅是由PPARα的肝臟氧化作用導(dǎo)致的，故該試驗(yàn)中玉米油并不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可作為正常對(duì)照組。宮內(nèi)暴露DEHP子代雄性大鼠生后體重的增長(zhǎng)與正常對(duì)照組比較，其結(jié)果無顯著差異［7］。Posnack et al［8］認(rèn)為暴露于 DEHP 的心肌細(xì)胞，其代謝元件受到影響，尤其長(zhǎng)期脂酸的形成可激起心臟出現(xiàn)缺血損害及心室功能不全。

應(yīng)用左心室插管測(cè)定心臟血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)，可以直接采集并實(shí)時(shí)定量分析各種血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)，與超聲心動(dòng)圖方法測(cè)定心功能比較，更能精準(zhǔn)地監(jiān)測(cè)心臟功能學(xué)的微小變化。心臟的工作性能主要取決于心室肌的收縮和舒張性能，常以LVSP和+dp/dtmax反映左心室的收縮功能;以LVEDP、－dp/dtmax反映左心室的舒張性能，反映了心室的充盈度、舒張功能及順應(yīng)性。該研究通過宮內(nèi)暴露DEHP的子代雌性成年大鼠的血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)的比較，發(fā)現(xiàn)高劑量組的LVSP、+dp/dtmax及－dp/dtmax明顯低于正常對(duì)照組及低劑量組（10 mg/kg），LVEDP明顯升高，說明高劑量組心臟的收縮功能及舒張功能均受到影響。DEHP低劑量時(shí)，心率略增加，LVSP也是略增加的;而DEHP高劑量組的心率繼續(xù)增加時(shí)，LVSP反而下降。這也符合心率影響心肌收縮力的變化規(guī)律。宮內(nèi)暴露DEHP的子代成年雌性大鼠的收縮功能減低，可能是DEHP的代謝物MEHP引起與心臟的負(fù)性變力效應(yīng)［9］。Gillum et al［10］也證實(shí)了臨床濃度的DEHP可使電耦合的調(diào)節(jié)能力明顯低下，也是成為心功能顯著損害的可能因素。

另一方面，該研究顯示宮內(nèi)暴露DEHP的子代雌性大鼠的心肌組織都有不同程度的損害，且以高劑量組的心肌組織損害更為顯著。主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞肥大，心肌纖維排列紊亂、斷裂，核固縮、深染，線粒體嵴斷裂、模糊等。這些結(jié)果可能是導(dǎo)致左心室順應(yīng)性減低、心肌收縮的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)受到破壞和心肌細(xì)胞能量供應(yīng)受限的原因，從而減弱心臟舒張和收縮能以及心力儲(chǔ)備，導(dǎo)致心臟血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)異常。

本研究探討宮內(nèi)DEHP暴露對(duì)子代雌性大鼠的體重及心臟功能的影響，結(jié)果顯示宮內(nèi)DEHP的暴露，不僅可以導(dǎo)致子代雌性出現(xiàn)肥胖癥等癥狀，還存在顯著的心臟血流動(dòng)力學(xué)異常和心肌超微結(jié)構(gòu)的損傷，值得臨床進(jìn)一步關(guān)注。

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Maternal in utero exposure todi-（2-ethylhexyl）phthalate affects the heart of adult female offspring

Zhao Qingsong1，F(xiàn)ang Rui2，Wu De1，et al
（1Dept of Pediatrics，The First Hospital of Anhui Medical University，Hefei230022;2Dept of Pediatrics，The Second Hospital of Anhui Medical University，Hefei230601）

ObjectiveTo investigate the cardiac effects of DEHP exposure during pregnancy on female rats offspring.MethodsPregnant SD rats were gavaged from gestationa day 0 until birth with corn oil，low ［10 mg/（kg·d）］dose DEHP and high［100 mg/（kg·d）］dose DEHP.Each group consists of two pregnant dams.The outcomes of general morphometry（weight），cardiac histology and cardiac function were studied.Results① When exposed to DEHP during pregnancy，body weight of female rats offspring increased from PND 0（Postnatal day 0）to PND 70.The increase level of weight was significantly higher in high dose group at PND 70（P＜0.05）.②Compared with control group and low dose DEHP group，the heart rate（HR）and left ventricular end-diastolic pressure（LVEDP）of female adult rats were deteriorated in the high dose DEHP group，while left ventricular systolic pressure（LVSP），maximal rise velocity of left ventricular pressure（+dp/dtmax）and maximal fall velocity of left ventricular pressure（－dp/dtmax）of that were significantly decreased（P＜0.05）.③ The cardiac histology effects of high dose DEHP exposure as follows:Pathological observation demonstrated cardiac myocyte hypertrophy，myocardial fiber disarray，a large number of myocardial cells karyopycnosis and stained;electron microscopy showed a lot of myocardial cells karyopycnosis and stained，myocardial fiber disorder and fracture arrangement，most of mitochondrial cristae were broken and blurred.However，no obvious change was found in the control group and low dose DEHP group.ConclusionHigh dose DEHP exposure in utero may lead weight increase，hemodynamic and myocardial abnormalities of female rats offspring.

Di（2-ethylhexyl）phthalate;embryo;myocardial cells;cardiac function

R 725.4

A

1000－1492（2014）05－0618－04

2014－01－05接收

安徽省教育廳自然科學(xué)重點(diǎn)項(xiàng)目（編號(hào):KJ2007A096）

1安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，合肥 230022

2安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院兒科，合肥 230601

趙青松，女，碩士研究生;

都鵬飛，男，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail:dpf.ayfy@163.com