外源性Leptin減輕大鼠肺缺血再灌注損傷及其保護作用機制

龔文輝，張成鑫，華天鳳，汪裕琪，黃大可，趙 強

外源性Leptin減輕大鼠肺缺血再灌注損傷及其保護作用機制

龔文輝1，2，張成鑫3，華天鳳2，汪裕琪2，黃大可4，趙 強1

目的 研究大鼠肺缺血再灌注損傷后血清炎癥因子及肺組織相關(guān)酶活性的變化，并探討外源性瘦素（Leptin）在肺缺血損傷中的作用及可能機制。方法 建立大鼠肺缺血再灌注損傷模型，并用外源性Leptin干預治療，對各組術(shù)后肺組織勻漿中丙二醛（MDA）、髓過氧化物酶（MPO）、超氧化物歧化酶（SOD）的活性、血清C反應蛋白（CRP）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和核因子-κB（NF-κB）濃度進行分析和比較，并觀察各組肺組織病理學改變。結(jié)果 缺血再灌注組血清炎癥指標CRP、TNF-α、NF-κB濃度較假手術(shù)組明顯升高，用外源性Leptin預處理后的炎癥指標濃度較缺血再灌注組有顯著下降（P＜0.05）。肺組織勻漿MPO、MDA水平測定結(jié)果同樣顯示Leptin預處理組的肺組織勻漿酶學指標較缺血再灌注組有顯著下降（P＜0.05）。組織學病理顯示缺血再灌注組肺損傷嚴重;Leptin預處理組肺泡結(jié)構(gòu)較完整，炎癥改變相對較輕，水腫及出血較再灌注組明顯減少。結(jié)論運用外源性Leptin后肺缺血再灌注損傷明顯減輕;外源性Leptin對肺缺血再灌注損傷有保護作用，可能與減輕脂質(zhì)過氧化反應及炎性細胞浸潤有關(guān)。

瘦素;肺損傷;肺保護;缺血再灌注

肺缺血再灌注損傷可見于體外循環(huán)、肺移植、休克以及心肺復蘇等多種臨床情況，具有高發(fā)生率和高死亡率，嚴重影響患者遠期生存率。近來研究［1］顯示，瘦素（Leptin）參與了多種急慢性肺損傷的發(fā)展過程，對呼吸系統(tǒng)具有重要的免疫調(diào)節(jié)作用。該實驗通過建立大鼠肺缺血再灌注損傷模型，探討外源性Leptin對肺缺血-再灌注損傷的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 將30只健康成年清潔級大鼠隨機均分成假手術(shù)組、缺血再灌注組及Leptin預處理組。實驗動物均購自安徽醫(yī)科大學實驗動物中心，動物實驗報安徽醫(yī)科大學動物倫理委員會審批同意。

1.2 主要試劑及儀器 戊巴比妥鈉購自美國Sigma公司;10%多聚甲醛緩沖液、2.5%戊二醛溶液購自上海譜振生物科技有限公司;丙二醛（malondialdehyde，MDA）、髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒購自南京建成生物工程研究所;C反應蛋白（C-reactive protein，CRP）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）ELISA 試劑盒購自上海信裕生物科技有限公司;大鼠Leptin購自美國PeproTech中國公司。HX-300S小動物呼吸機購自成都泰盟科技有限公司。

1.3 實驗過程 參照相關(guān)文獻［2］及之前建立模型的經(jīng)驗［3］，建立大鼠肺再灌注損傷模型。術(shù)前12 h禁食不禁水，1%戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射麻醉后，尾靜脈注射肝素（100 U/kg）;手術(shù)過程中適量追加戊巴比妥鈉，每次5 mg。仰臥位固定，氣管切開后插管，接動物呼吸機行機械通氣（吸入室內(nèi)空氣，呼吸頻率60次/min，潮氣量單側(cè)肺通氣8～10 ml/kg，雙側(cè)肺通氣 15～20 ml/kg，吸呼比為1∶2）。沿胸骨左緣切斷第3、4、5肋骨進胸。顯露肺門，游離左肺動脈、左主支氣管和左肺靜脈。在肺充氣狀態(tài)下以無損傷微血管夾依次阻斷左肺動脈、左主支氣管和左肺靜脈。阻斷1 h后去血管夾，依次開放左肺動脈、左主支氣管和左肺靜脈，再灌注2 h后切除左肺。假手術(shù)組:無缺血過程，余同缺血再灌注組。Leptin預處理組:參照有關(guān)文獻［4］使用劑量，取Leptin 20 μg/kg溶解于0.5 ml鹽水于大鼠制模術(shù)前6 h行腹腔注射，余同缺血再灌注組。

1.4 指標測量

1.4.1 血清 CRP、TNF-α、NF-κB 濃度 取血清樣品，ELISA 法檢測 CRP、TNF-α、NF-κB 濃度。按照試劑盒說明書步驟進行測定，計算樣品濃度。

1.4.2 肺組織MPO、MDA、SOD水平測定 取凍存于－70℃ 的肺組織塊稱重，放入盛有冰冷生理鹽水的玻璃勻漿器中，調(diào)整其濃度為0.2 g/ml，在冰浴中上下轉(zhuǎn)動研磨數(shù)十次，充分研碎，使組織勻漿化。離心后取0.5 ml肺組織勻漿液用于MPO的測定;取0.5 ml肺組織勻漿上清液用于MDA、SOD檢測，按照試劑盒說明書（比色法）步驟測定MPO、SOD活性和MDA含量。

1.4.3 肺組織病理觀察 在左肺上葉相同部位取小塊肺組織10%甲醛固定，石蠟包埋切片，進行HE染色觀察肺組織形態(tài)學變化。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，采用完全隨機設(shè)計的單因素方差分析及SNK-q檢驗法進行兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1 血清炎癥因子及肺組織酶活性檢測 缺血再灌注組血清炎癥指標 CRP、TNF-α、NF-κB 濃度較假手術(shù)組明顯升高，見表1。Leptin預處理組的炎癥指標較缺血再灌注組有顯著下降（P＜0.05）。缺血再灌注組肺組織勻漿MPO、MDA較假手術(shù)組明顯升高，缺血再灌注組SOD較假手術(shù)組有所上升，但差異無統(tǒng)計學意義;肺組織MPO、MDA、SOD水平測定結(jié)果顯示Leptin預處理組的酶學指標較缺血再灌注組有顯著下降（P＜0.05）。

表1 3 組大鼠血清 CRP、TNF-α、NF-κB 濃度及肺組織MPO、MDA、SOD水平比較（n=10，±s）

表1 3 組大鼠血清 CRP、TNF-α、NF-κB 濃度及肺組織MPO、MDA、SOD水平比較（n=10，±s）

與假手術(shù)組比較:*P＜0.05;與缺血再灌注組比較:#P＜0.05

項目 假手術(shù)組 缺血再灌注組 Leptin預處理組 F值CRP（μg/ml） 103.8±18.9 260.3±53.6* 162.7±66.4#47.947 TNF-α（ng/ml） 1.67 ±0.12 16.29 ±0.19* 9.63 ±1.35# 100.651 NF-κB（ng/ml） 0.236 ±0.10 6.780 ±0.24* 4.360 ±1.38# 95.701 MPO（U/ml） 0.166 ±0.08 0.736 ±0.31* 0.436 ±0.25# 65.376 MDA（nmol/ml） 2.36 ±0.67 4.51 ±0.80* 2.78 ±0.51# 63.969 SOD（U/ml） 109±19 118±31 68±28#32.779

2.2 組織學改變比較 光鏡檢查顯示假手術(shù)組肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔清晰，少量細胞浸潤及水腫出血;缺血再灌注組肺泡壁彌漫性滲出水腫，毛細血管擴張充血，肺泡壁和肺間質(zhì)內(nèi)可見大量白細胞浸潤以及肺泡結(jié)構(gòu)的破壞;Leptin預處理組肺泡結(jié)構(gòu)較完整，肺泡腔清晰，炎癥改變相對較輕，水腫、出血及白細胞浸潤較假手術(shù)組重但較缺血再灌注組輕。見圖1。

圖1 肺組織光鏡檢查 ×100

3 討論

肺缺血再灌注損傷可見于心臟體外循環(huán)手術(shù)、肺移植、休克以及心肺復蘇等臨床情況，并可造成急性呼吸窘迫綜合征，嚴重影響患者長期生存率。其發(fā)生機制目前尚未完全明確，可能與全身炎癥反應的激活、細菌感染、免疫反應、免疫介質(zhì)等有關(guān)［5］:氧自由基的釋放及脂質(zhì)過氧化反應;細胞內(nèi)的鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào);炎性細胞大量浸潤及炎性介質(zhì)的釋放引起過度的炎癥反應;細胞凋亡等［6］。

MDA是脂質(zhì)過氧化物中的一種，MDA含量不僅反映機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，也可以作為判斷氧自由基產(chǎn)生和組織氧化應激損傷嚴重程度的重要標志。MPO是中性粒細胞特異性酶，組織內(nèi)MPO活性高低可作為中性粒細胞浸潤和激活程度的定量指標［7］。此外，肺缺血再灌注還可激活NF-κB，其表達水平與缺血再灌注損傷損傷程度呈正相關(guān)。同樣，本實驗中顯示缺血再灌注損傷組的術(shù)后MPO、MDA、NF-κB濃度水平明顯增高，可見其可以作為肺損傷炎癥反應及肺損傷程度的指標。而實驗中缺血再灌注組SOD較假手術(shù)組有所上升，但差異無統(tǒng)計學意義，可能與實驗誤差有關(guān)。

近年來研究［1］表明Leptin參與了急慢性肺損傷的發(fā)展過程，并顯示肺損傷后，血漿中Leptin的濃度明顯增加。Leptin是一種主要由脂肪細胞分泌的具有廣泛生物學活性的蛋白質(zhì)，首先是作為一種參與能量代謝、促進脂肪消耗、降低體重的蛋白質(zhì)而被人們所認識。后發(fā)現(xiàn)Leptin在炎癥反應、造血過程、血管生成以及生殖中發(fā)揮重要作用［8］，并發(fā)現(xiàn)Leptin參與機體應激狀態(tài)下內(nèi)環(huán)境的恢復，對機體有一定保護作用［9］。急性感染、炎性刺激時血漿CRP、TNF-α增高，刺激脂肪組織釋放儲存的Leptin，使血漿Leptin水平增加［10］。Leptin同時也是一種應激激素，在應激時對機體有保護作用，促進免疫應答、增強血細胞分化成熟、對抗休克和感染導致的多臟器功能損害，在炎癥反應和免疫應答中起著重要的調(diào)節(jié)作用［11］。

綜上所述，運用外源性Leptin后肺缺血再灌注損傷明顯減輕，其作用機制可能與減輕脂質(zhì)過氧化反應及炎性細胞浸潤有關(guān)。本實驗為臨床治療肺缺血再灌注損傷提供一定的理論支持。本研究不足之處是僅設(shè)計了一個藥物劑量組，如果同時設(shè)置一陰性藥對照組或生理鹽水組可能使研究結(jié)果更合理。

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Effects and mechanisms of exogenous Leptin alleviating rat lung ischemia-reperfusion injury

Gong Wenhui1，2，Zhang Chengxin3，Hua Tianfeng2，et al
（1Dept of Cardiac Surgery，Ruijin Hospital，Shanghai Jiaotong University，Shanghai200025;2Dept of Cardiothoracic Surgery，The Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei230601;3Dept of
Cardiac Surgery，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei230022）

ObjectiveRats serum inflammatory factors and enzyme activities of lung tissue were measured to investigate the protective role and mechanisms of exogenous Leptin alleviating rat lung ischemia-reperfusion injury.MethodsRats lung ischemia-reperfusion injury models were established and one group was treated with exogenous Leptin.Plasma concentrations of C-reactive protein（CRP），tumor necrosis factor-α （TNF-α）and nuclear factorκB（NF-κB）were measured by ELISA.The activity of malondialdehyde（MDA），myeloperoxidase（MPO），superoxide dismutase（SOD）of lung homogenates were measured using colorimetric assay，and the morphological changes were observed under a microscope.ResultsIn ischemia-reperfusion group，CRP，TNF-α，NF-κB concentration were significantly higher than that of the sham group，and the concentration of exogenous Leptin group was significantly decreased compared with the value of ischemia-reperfusion group（P＜0.05）.The lung tissue enzymatic indicators examination also showed that the MPO，MDA levels of exogenous Leptin pretreatment had significantly decreased（P＜0.05）compared with ischemia-reperfusion group（P＜0.05）.Histological study showed relatively mild inflammation，edema and bleeding in exogenous Leptin treatment group with alveolar structure intact compared with ischemia-reperfusion injury group.ConclusionLung ischemia-reperfusion injury was significantly alleviated after application of exogenous Leptin.The exogenous Leptin may play a protective role in lung ischemiareperfusion injury through reducing lipid peroxidation and inflammatory cell infiltration.

Leptin;lung injury;lung protection;ischemia-reperfusion

R 655.3;R 332.2;R 452

A

1000－1492（2014）05－0603－04

2013－12－20接收

安徽省教育廳高校省級自然科學研究項目（編號:KJ2012Z161）

1上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院心臟外科，上海200025

2安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院心胸外科，合肥 2306013安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院心臟外科，合肥 2300224安徽醫(yī)科大學生物化學與分子生物學教研室，合肥230032

龔文輝，男，博士研究生，主治醫(yī)師;

趙 強，男，教授，主任醫(yī)師，博士生導師，責任作者，E-mail:zq11607@rjh.com.cn