從江香豬基因組中2個拷貝數(shù)變異區(qū)的多態(tài)性研究

趙恒鑫，何樹芳，王嘉福，冉雪琴

(1.貴州大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽550025；2.貴州大學(xué) 農(nóng)業(yè)生物工程重點實驗室，貴州 貴陽，550025)

從江香豬基因組中2個拷貝數(shù)變異區(qū)的多態(tài)性研究

趙恒鑫1，2，何樹芳1，2，王嘉福2，冉雪琴1*

(1.貴州大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽550025；2.貴州大學(xué) 農(nóng)業(yè)生物工程重點實驗室，貴州 貴陽，550025)

為了研究從江香豬生長和繁殖差異與拷貝數(shù)變異拷貝數(shù)變異(copy number variation，CVN)之間的關(guān)系，采用實時熒光定量PCR方法，對從江香豬和大白豬基因組中的CNVR100與CNVR373的拷貝數(shù)進(jìn)行了測定，并分析了從江香豬拷貝數(shù)與生長繁育性狀之間的相關(guān)性。結(jié)果表明，從江香豬和大白豬基因組中都檢測到CNVR100和CNVR373；與大白豬相比，從江香豬的CNVR100拷貝數(shù)較低，CNVR373拷貝數(shù)較高；相關(guān)性分析結(jié)果顯示，從江香豬2個CNVRs與其體長和胸圍有一定的負(fù)相關(guān)關(guān)系，表明這2個CNVRs的多態(tài)性可能對從江香豬的生長有一定的影響。

拷貝數(shù)變異；KIT基因；嗅覺受體；從江香豬

從江香豬是20世紀(jì)70年代末期，在貴州都柳江上游與廣西壯族自治區(qū)接壤山區(qū)發(fā)現(xiàn)的一種小型地方豬種，其中心產(chǎn)區(qū)在貴州從江縣的宰便、秀塘、加鳩等鄉(xiāng)鎮(zhèn)。經(jīng)過長期的自然和人為的選擇，形成了從江香豬肉質(zhì)優(yōu)良、耐粗飼、近交不退化等特點。香豬群體個體間的生長繁育性狀的個體差異較大，3～8 月齡期間平均日增重152～186 g，窩產(chǎn)仔數(shù)范圍為5～21 頭[1-2]。近年來的研究表明，基因組中存在拷貝數(shù)變異(copy number variation，CNV)現(xiàn)象，并導(dǎo)致動物的表型發(fā)生改變[3]。CNV是2004年由Iafrate和Sebat研究小組從人類基因組中首次發(fā)現(xiàn)[4-5]，主要指基因組中1 kb以上的DNA片段的插入、缺失和/或擴(kuò)增，及其互相組合衍生出的復(fù)雜染色體結(jié)構(gòu)變異[6]。CNV的分布范圍廣，可以遺傳，并具有高度異質(zhì)性，其變異可引起基因的劑量/位置效應(yīng)、發(fā)生基因的斷裂或融合[7]，是與動物表型標(biāo)志相關(guān)的基因組DNA多態(tài)性[8]。從江香豬群體中存在的生長繁育性狀差異是否與其CNV的多態(tài)性有關(guān)，目前未見相關(guān)報道。本文選取豬8號染色體上的CNVR100、9號染色體上的CNVR373[9-10]兩個CNVRs(CNV regions)，通過實時熒光定量PCR方法(Real-time quantitative polymerase chain reaction，qPCR)研究從江香豬基因組中CNVR100與CNVR373的多態(tài)性變化，探討2個CNVRs與從江香豬生長繁育特點之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

63頭從江香豬血液樣本采自從江縣宰便鎮(zhèn)、秀塘鄉(xiāng)等地，全部香豬健康，年齡8月齡至2歲。23份大白豬血液樣本采自貴州大學(xué)豬場，8～12月齡。用鋼卷尺、皮尺、磅秤、測杖等測量從江香豬的體重、體高、體寬、體長、胸圍、腹圍、管圍7項指標(biāo)，調(diào)查記錄乳頭數(shù)和產(chǎn)仔數(shù)數(shù)據(jù)。

1.2 提取血液基因組

參照血液基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)說明提取基因組DNA。

1.3 PCR擴(kuò)增

根據(jù)豬CNVR100及CNVR373中的保守區(qū)段使用Primer Premier 5.0設(shè)計引物(表1)，以拷貝數(shù)保守(固定為2個拷貝)的col10基因作為對照[11]，以血液基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增，回收目的片段，連接pGEM-T載體(Promega)，陽性克隆測序。引物合成和序列測定由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.4 實時熒光定量PCR

應(yīng)用SYBR試劑盒(SYBR PremixEx TaqTM，TaKaRa)進(jìn)行qPCR，反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，(40 個循環(huán))；95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，95 ℃ 15 s。

2-△Ct=2-(CtCNV-Ctcontrol)

表1 基因組qPCR引物Table 1 Primers for the genomic qPCR detection

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)用SPSS v17.0，Pearson雙側(cè)檢驗方法評價CNV拷貝數(shù)與生長繁殖指標(biāo)之間的相關(guān)性。

2 結(jié) 果

2.1 從江香豬體尺指標(biāo)測定

測量了63頭香豬的體尺(表2)。香豬體尺較小，其中體長變化范圍為78～83 cm，胸圍范圍為75～86 cm，產(chǎn)仔數(shù)范圍6～11頭。

表2 從江香豬的體尺和部分繁殖參數(shù)測定Table 2 Indexes of body size and partial reproductive parameters of Congjiang Xiang pig

2.2 PCR擴(kuò)增片段的克隆測序

以從江香豬血液基因組DNA為模板，采用特異性引物F1/R1、F2/R2、F3/R3分別進(jìn)行擴(kuò)增，回收擴(kuò)增片段，插入pGEM-T載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，陽性重組子測定核苷酸序列(圖1)。經(jīng)NCBI在線比對，擴(kuò)增片段與已知豬參考基因組序列相應(yīng)片段的相似性為100%(Scrofa 10.2)，證明擴(kuò)增片段確為CNVR100、CNV373和collo基因片段。

圖1 基因擴(kuò)增片段序列Fig.1 Blast analysis for the sequences of amplified fragments

圖2 以重組質(zhì)粒為模板的標(biāo)準(zhǔn)曲線制作Fig.2 Standard curve for qPCR taking recombinant plasmid as templates

圖3 qPCR 的熔解曲線Fig.3 Melting curve of qPCR

2.3 擴(kuò)增效率

將重組質(zhì)粒DNA稀釋為100，10-1，10-2，10-3，10-4，每個稀釋梯度設(shè)置三次平行檢測，確定最適退火溫度(表3)，測定標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)，計算擴(kuò)增效率均在100%±10%以內(nèi)(表3)。所有樣品的熔解曲線均為單峰(圖3)。

表3 引物的最適退火溫度及擴(kuò)增效率Table 3 The annealing temperature and amplification efficiency of primer pairs

2.4 從江香豬2個CNVR拷貝數(shù)檢測

2.4.1 CNVR100拷貝數(shù)測定 以從江香豬基因組DNA為模板，使用特異性引物F1/R1擴(kuò)增，獲得69 bp的DNA片段，沒有引物帶(圖4)。通過qPCR擴(kuò)增，3次平行測定Ct值，計算CNVR100的起始模板拷貝數(shù)，得出從江香豬基因組中CNVR100的拷貝數(shù)為1.16±0.89 個，大白豬的拷貝數(shù)為2.19±0.65，經(jīng)顯著性檢驗其間差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)。

2.4.2 CNVR373拷貝數(shù)測定 使用特異性引物F2/R2，自從江香豬基因組中擴(kuò)增得到108 bp的片段，沒有引物帶。qPCR分析，計算出CNVR373的起始模板拷貝數(shù)，從江香豬為3.36±1.09，大白豬為1.53±0.68，之間的差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)。

2.5 CNV變異與生長繁殖指標(biāo)的相關(guān)性分析

將63份從江香豬樣品的基因組CNVR100與CNVR373的拷貝數(shù)與其體尺和產(chǎn)仔數(shù)等參數(shù)之間進(jìn)行相關(guān)性分析(表4)，得出從江香豬CNVR100 和CNVR373的拷貝數(shù)與其體長、胸圍之間的相關(guān)系數(shù)0.25

表4 從江香豬2個CNV與其體尺和繁殖性狀間的相關(guān)分析Table 4 Correlation analysis of two CNVs with the body size and reproduction traits in Congjiang Xiang pig

注：a代表在0.05水平差異顯著。

Notes: Letter “a”means significant difference at 0.05 level.

圖4 血液基因組樣品CNV的qPCR檢測

3 討 論

3.1 CNVR100拷貝數(shù)與香豬生長繁育性狀之間的關(guān)系

自從江香豬和大白豬血液基因組DNA中檢測到CNVR100存在拷貝數(shù)變異，從江香豬CNVR100的拷貝數(shù)范圍為1～8 個拷貝，平均1.16±0.89 個，大白豬的拷貝數(shù)為2.19±0.65。以往的研究表明，杜洛克、榮昌豬CNVR100的拷貝數(shù)為1～8個[12]，與本文的研究結(jié)果相近。

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，從江香豬的CNVR100拷貝數(shù)與其體長、胸圍之間為弱的負(fù)相關(guān)關(guān)系。CNVR100位于豬基因組中第8條染色體(35580750-36119848)，總長共有539099 bp[9]，其中包含的唯一的基因是KIT。KIT為原癌基因，編碼干細(xì)胞生長因子受體(mast/stem cell growth factor receptor MGF/SGF)，干細(xì)胞因子(stem cell factor，SCF)與KIT結(jié)合，調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞、消化道細(xì)胞、肥大細(xì)胞、生殖細(xì)胞等的生長發(fā)育和分化，對個體的生長發(fā)育起多方面的調(diào)節(jié)作用[13]。從江香豬基因組CNVR100的拷貝數(shù)低于大白豬的相應(yīng)值。從江香豬的體長、胸圍明顯低于大白豬，大白豬180日齡體長平均為101.54 4.97 cm，胸圍平均為96.60 4.46 cm[14]。提示CNVR100的低拷貝可能影響從江香豬的體長和胸圍的生長。

3.2 CNVR373拷貝數(shù)與香豬生長繁育性狀間的關(guān)系

經(jīng)檢測，從江香豬和大白豬血液基因組DNA中存在CNVR373的變異，實驗得出從江香豬CNVR373拷貝數(shù)的平均值為3.36±1.09，大白豬為1.53±0.68，二者之間的差異顯著(P<0.05)。CNVR373位于豬9號染色體上(4203824-4364337)，區(qū)域全長160513 bp[10]，該區(qū)域中含有的基因均為嗅覺受體基因。從江香豬的CNVR373拷貝數(shù)高于大白豬，可能是從江香豬的嗅覺較為靈敏的原因之一。由CNVR373拷貝數(shù)與體尺和部分繁殖指標(biāo)間的相關(guān)性分析可知，CNVR373拷貝數(shù)與從江香豬的體長、胸圍有弱的負(fù)相關(guān)關(guān)系。結(jié)合從江香豬的體長和胸圍明顯小于大白豬，提示CNVR373拷貝數(shù)較高可能參與從江香豬的體長和胸圍的生長調(diào)節(jié)。

本文的研究結(jié)果表明，從江香豬基因中存在CNVR100和CNVR373變異；與大白豬相比，從江香豬基因組中CNVR100的拷貝數(shù)較低，香豬的CNVR373拷貝數(shù)較高，并與從江香豬的體長和胸圍有一定的負(fù)相關(guān)關(guān)系，這兩個CNVR對從江香豬的生長和發(fā)育可能有一定的調(diào)節(jié)作用。

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PolymorphismofTwoCNVsintheGenomeofCongjiangXiangPiginGuizhou

ZHAO Heng-xin1，2,HE Shu-fang1，2,WANG Jia-fu2,RAN Xue-qin1*

(1.FacultyofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025,China；2.KeyLaboratoryforAgriculturalBioengineeringofGuizhouProvince,Guiyang，Guizhou550025,China)

To investigate the polymorphism of copy number variation(CNV) and its relationship with growth and reproduction of Congjiang Xiang pig,two CNVR numbers of Congjiang Xiang pig were determined by real-time quantitative polymerase chain reaction(qPCR),taking Yorkshire pig as control.The results showed that both of CNVR100 and CNVR373 were detected from the genome of Congjiang Xiang and Yorkshire pig breeds.The copy numbers of CNVR100 was lower and CNVR373 copies was higher in Congjiang Xiang pig than that in Yorkshire.Further more,copies of two CNVRs were weakly negatively correlated with the value of body length and chest circumference of Congjiang Xiang pig.The results suggested that both of two CNVs,CNVR100 and CNVR373,might effect on the growth of body trunk and chest in Congjiang Xiang pig.

copy number variation;KIT gene;olfactory receptor;qPCR;Congjiang Xiang pig

2013-12-28，

2014-01-14

國家“863”課題(2013AA102503)，國家科技支撐計劃(2008BADB5B02)，貴州省農(nóng)業(yè)攻關(guān)項目(黔科合NY[2013]3073)

趙恒鑫(1988-)，男，山東蓬萊人，碩士生，研究方向：動物生理與分子生物學(xué)。E-mail: zmshyx@aliyun.com

*[通訊作者]冉雪琴(1967-)，女，重慶忠縣人，教授，研究方向：動物生理與分子生物學(xué)。E-mail：as.xqran@gzu.edu.cn

S811.6

A

1005-5228(2014)09-0019-04