• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    愛玉ISSR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化*

    2014-09-05 09:24:34黃其梅葉美娜阮少江
    關(guān)鍵詞:條帶用量引物

    史 輝,黃其梅,葉美娜,阮少江,陳 勇

    (1.寧德師范學(xué)院生物系,福建 寧德 352100;2.閩東特色生物資源福建省高校工程研究中心,福建 寧德 352100)

    愛玉ISSR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化*

    史 輝1,2,黃其梅1,葉美娜1,阮少江1,2,陳 勇1,2

    (1.寧德師范學(xué)院生物系,福建 寧德 352100;2.閩東特色生物資源福建省高校工程研究中心,福建 寧德 352100)

    通過單因子試驗(yàn)和正交設(shè)計(jì),對(duì)影響愛玉ISSR-PCR擴(kuò)增效果的因素,如模板DNA用量、Taq酶用量、dNTPs濃度、引物濃度、延伸時(shí)間和循環(huán)次數(shù)等指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化.實(shí)驗(yàn)確立了可用于愛玉ISSR-PCR分析最適宜的反應(yīng)體系:20 μL反應(yīng)體積中含1 ng模板DNA、1.0 U Taq酶、0.4 μmol/L引物和0.18 mmol/L dNTPs;PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性45 s,53 ℃退火45 s,72 ℃延伸2.5 min,共35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸7min,4 ℃保存.應(yīng)用該體系對(duì)14份愛玉種質(zhì)進(jìn)行擴(kuò)增,證實(shí)了該體系的適用性和穩(wěn)定性.

    愛玉;ISSR;反應(yīng)體系;正交設(shè)計(jì)

    愛玉(FicuspumilaL. var.awkeotsang)是桑科榕屬(Moraceae,Ficus)植物,分布于中國的福建省東北部、浙江南部和臺(tái)灣.愛玉瘦果制成的愛玉凍是一種高貴的天然食品,富含果膠、維生素和礦質(zhì)元素,且糖分與脂肪含量較低,可作為低脂低熱食品研發(fā)的重要資源,具有良好的應(yīng)用前景.近年來愛玉栽培面積不斷擴(kuò)大,對(duì)優(yōu)良品系的需求越來越多.目前,人們對(duì)愛玉遺傳背景不是很了解,為防止因偽劣品系或品系混亂造成生產(chǎn)損失,對(duì)愛玉優(yōu)良品系進(jìn)行準(zhǔn)確鑒別尤為重要.

    簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增(Inter-simple sequence repeats,ISSR)是在微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)上發(fā)展起來的標(biāo)記技術(shù),具有多態(tài)性高和產(chǎn)物特異性強(qiáng)等特點(diǎn)[1],廣泛應(yīng)用于植物品種鑒定、基因定位、遺傳作圖、遺傳多樣性、進(jìn)化及分子生態(tài)學(xué)研究.目前,ISSR技術(shù)已在香蕉、芒果、柑橘等多種果樹上得到廣泛應(yīng)用,但在關(guān)于愛玉的研究還未見報(bào)道.不同植物的ISSR反應(yīng)體系中各成分用量、擴(kuò)增程序和適宜引物均不同[2],因此進(jìn)行體系優(yōu)化是研究的前提.筆者采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)相結(jié)合的實(shí)驗(yàn)方法,建立愛玉ISSR-PCR最適反應(yīng)體系,以期為愛玉種質(zhì)資源鑒定與引種等奠定研究基礎(chǔ).

    1 材料和方法

    1.1材料

    1.1.1 試材 供試材料為愛玉太6品系基因組DNA,采自福州閩侯南嶼鎮(zhèn)愛玉生態(tài)研究園.

    1.1.2 試劑 Taq DNA聚合酶與DL2000 Marker均購自Takala公司,引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成,瓊脂糖為西班牙Biowest進(jìn)口分裝,其他試劑均為國藥分析純.

    1.1.3 儀器 梯度PCR擴(kuò)增儀(美國Biometra C-412),移液槍(法國吉爾森 Ppetman系列),制冰機(jī)(Scotsman AF100-AS),超純水系統(tǒng)(美國MILLI-Q),渦旋振蕩器(德國IKAMS3digital),電泳儀(北京六一DYY-10C型),紫外透射儀(上海嘉鵬科技有限公司ZF),凝膠成像系統(tǒng)(Bio-rad GelDoc EZ).

    1.2方法

    1.2.1 ISSR-PCR反應(yīng)體系單因子優(yōu)化 選用UBC808引物(序列為(AG)8C),模板為愛玉太6品系DNA,分別對(duì)影響ISSR-PCR擴(kuò)增的DNA模板用量、Taq酶用量、引物濃度、dNTPs濃度、循環(huán)次數(shù)和延伸時(shí)間等6個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化.分別設(shè)置11個(gè)模板用量為0.05,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,1,2,3,4,5 ng;10個(gè)Taq酶用量為0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1.0,1.1,1.2 U;10個(gè)引物用量為0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1.0 μmol/L;10個(gè)dNTPs濃度為0.10,0.12,0.14,0.16,0.18,0.20,0.22,0.24,0.26,0.28 mmol/L;5個(gè)循環(huán)數(shù)為25,30,35,40,45個(gè);5個(gè)延伸時(shí)間為1.0,1.5,2.0,2.5,3 min.初始反應(yīng)體系為:模板DNA 1 ng;808引物0.5 μmol/L;10*buffer 2 μL;dNTPs 0.20 mmol/L;Taq酶 0.5 U;補(bǔ)ddH2O至20 μL.初始PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min,94 ℃變性45 s,53 ℃退火45 s,72 ℃延伸90 s,共35個(gè)循環(huán);72 ℃最后延伸7 min,4 ℃保存[3].擴(kuò)增結(jié)束后,產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖電泳檢測(cè),凝膠成像系統(tǒng)并拍照記錄數(shù)據(jù).比較各因素在不同梯度時(shí)的擴(kuò)增效果,每個(gè)因素的優(yōu)化條件作為后續(xù)的擴(kuò)增條件.

    1.2.2 ISSR-PCR反應(yīng)體系正交優(yōu)化 根據(jù)單因子試驗(yàn)初步確定Taq酶用量、引物濃度、dNTPs濃度、循環(huán)數(shù)和延伸時(shí)間后,采用L18(35)正交設(shè)計(jì)[4]對(duì)各個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化組合(見表1).參照文獻(xiàn)[4],以譜帶多態(tài)性高、主帶清晰、副帶明顯、背景低為原則,對(duì)正交實(shí)驗(yàn)各處理綜合評(píng)分,最高為10分,最低為1分.根據(jù)打分求出每個(gè)因素同一水平下的平均值ki,并求出極差R,得到愛玉ISSR-PCR反應(yīng)各因素的最佳組合.正交優(yōu)化試驗(yàn)因子和水平數(shù)見表1.

    表1 ISSR-PCR反應(yīng)體系正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表L18(35)

    1.2.3 優(yōu)化體系適用性檢測(cè) 為了驗(yàn)證優(yōu)化后體系的適用性和穩(wěn)定性,隨機(jī)選擇2個(gè)適宜引物,用此優(yōu)化的反應(yīng)體系對(duì)14份愛玉種質(zhì)進(jìn)行擴(kuò)增,驗(yàn)證其優(yōu)化效果.

    2 結(jié)果與討論

    2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果

    2.1.1模板用量對(duì)PCR的影響 模板用量對(duì)擴(kuò)增譜帶數(shù)量的影響不大(見圖1),主要影響譜帶的亮度,隨著用量的增加,條帶亮度略有增加,當(dāng)模板用量超過1 ng時(shí),條帶亮度不再增加.因此,模板量選用1 ng.

    2.1.2 Taq酶用量對(duì)PCR的影響 Taq酶用量對(duì)結(jié)果影響明顯(見圖2),當(dāng)Taq酶用量小于0.9 U時(shí),隨著酶用量的增加,擴(kuò)增條帶亮度明顯增加.達(dá)到0.9 U時(shí),條帶亮度最高,再增加酶的用量,條帶亮度降低,擴(kuò)增效果變差.當(dāng)達(dá)到1.2 U時(shí),幾乎無擴(kuò)增,因此0.9 U為Taq酶最適的用量.

    M—DL 2000;1—11分別表示5,4,3,2,1,0.5,0.4,0.3,0.2,0.1,0.05 ng模板DNA.

    M—DL 2000;1—10分別表示0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1.0,1.1,1.2 U Taq酶.

    2.1.3 dNTPs濃度對(duì)PCR的影響 在圖3中顯示,濃度在0.10~0.18 mmol/L范圍內(nèi),隨濃度的增加,條帶數(shù)量不變,清晰度略有增加,當(dāng)濃度超過0.18 mmol/L時(shí),條帶的數(shù)量和清晰度隨之下降,在大約250 bp處出現(xiàn)模糊分散的擴(kuò)增條帶,這是非特異性擴(kuò)增所致.為后續(xù)正交試驗(yàn)考慮,選中間的一個(gè)條帶較為清晰的濃度0.16 mmol/L作為適宜的dNTPs濃度.

    2.1.4 引物濃度對(duì)PCR的影響 如圖4,在一定范圍內(nèi),隨著引物濃度的增加,條帶的數(shù)量和清晰度隨之增加.當(dāng)引物濃度超過0.4 μmol/L時(shí),條帶的清晰度隨之下降,在250 bp處出現(xiàn)模糊的非特異性條帶.所以,引物濃度選擇0.4 μmol/L.

    M—DL 2000;1—10分別表示0.10,0.12,0.14,0.16,0.18,0.20,0.22,0.24,0.26,0.28 mmol/L dNTPs.

    M—DL 2000;1—10分別表示0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1.0 μmol/L 引物.

    2.1.5 延伸時(shí)間對(duì)PCR的影響 如圖5,隨著延伸時(shí)間的增加,條帶的數(shù)量、亮度和清晰度變化不大,有些大于2 000 bp的大片段雖有擴(kuò)增,但很模糊,后續(xù)條帶計(jì)數(shù)困難.為節(jié)約時(shí)間,延伸時(shí)間選2 min.

    2.1.6 循環(huán)數(shù)對(duì)PCR的影響 循環(huán)數(shù)決定PCR產(chǎn)物量.循環(huán)數(shù)少,產(chǎn)量少,條帶弱;循環(huán)數(shù)過多會(huì)引入非特異性擴(kuò)增.如圖6,25個(gè)循環(huán)幾乎無擴(kuò)增,隨著循環(huán)數(shù)的增加,條帶的亮度有增加趨勢(shì),但條帶數(shù)量明顯減少,有些大于750 bp的片段幾乎無擴(kuò)增.因此,30個(gè)循環(huán)是最適宜的延伸時(shí)間.

    M—DL 2000;1—5分別表示1,1.5,2,2.5,3 min延伸時(shí)間.

    M—DL 2000;1—5分別表示25,30,35,40,45循環(huán).

    2.2正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    圖7中,正交試驗(yàn)的所有處理均有擴(kuò)增條帶,但不同處理其擴(kuò)增條帶的數(shù)量、明亮度和清晰度不同.以譜帶多態(tài)性高、主帶清晰、副帶明顯、背景低為原則,對(duì)正交實(shí)驗(yàn)各處理綜合評(píng)分見表2.從各因素的K值可以看出,Taq酶為3水平(1.0 U)、引物為2水平(0.4 μmol/L)、dNTPs為3水平(0.18 mmol/L)、循環(huán)次數(shù)為1水平(30次)、延伸時(shí)間為3水平(2.5 min)時(shí)擴(kuò)增效果最好;從極差可以看出,循環(huán)次數(shù)對(duì)擴(kuò)增效果影響最大,30個(gè)循環(huán)明顯優(yōu)于其他循環(huán);延伸時(shí)間對(duì)擴(kuò)增效果有一定影響;Taq酶用量對(duì)擴(kuò)增效果影響最小.

    表2 ISSR反應(yīng)體系的正交試驗(yàn)結(jié)果L18(35)

    續(xù)表

    M—DL 2000;1—18為處理編號(hào).

    2.3優(yōu)化體系適用性檢測(cè)結(jié)果

    隨機(jī)選取UBC809和UBC864這2個(gè)引物,確定最佳退火溫度Tm后,采用該優(yōu)化體系對(duì)14份愛玉種質(zhì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,都能擴(kuò)增出比較清晰的條帶,且多態(tài)性較高(見圖8),說明該優(yōu)化后的反應(yīng)體系適于愛玉的ISSR-PCR擴(kuò)增.

    3 結(jié)論與分析

    研究表明,ISSR標(biāo)記是隨機(jī)標(biāo)記,影響ISSR-PCR的因素很多,反應(yīng)體系和反應(yīng)程序中的每個(gè)因子都對(duì)最終的擴(kuò)增效果有影響[5].但在各種擴(kuò)增參數(shù)固定的條件下,會(huì)表現(xiàn)出較高的穩(wěn)定性[6].因此,對(duì)ISSR-PCR反應(yīng)體系的各種影響因子如模板用量、Taq酶用量、dNTPs、引物濃度、Mg2+離子等因素進(jìn)行優(yōu)化和篩選是必要的,也是應(yīng)用該技術(shù)的前提[7].

    (1) 模板用量關(guān)系到PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量和特異性.當(dāng)模板用量過低時(shí),引物與模板結(jié)合的幾率小,擴(kuò)增效率低,條帶淺或無條帶;當(dāng)模板用量過高時(shí),非特異性條帶增加,同時(shí)也會(huì)增加模板之間配對(duì)的機(jī)會(huì),減少引物與模板的配對(duì),也可能將雜質(zhì)過多地帶入反應(yīng)體系[8-9].其他植物的研究發(fā)現(xiàn),ISSR-PCR反應(yīng)對(duì)模板DNA用量范圍要求較寬,20 μL反應(yīng)體系中一般為5~50 ng[10-11].但筆者在前期的研究中,模板量超過20 ng就幾乎沒有擴(kuò)增.可能是因?yàn)閻塾窕蚪M較小,少量的基因組DNA含有與其他植物等量的模板;也可能是因?yàn)閻塾袢~片多酚、多糖類次生物質(zhì)含量極高[12],模板DNA純度較低.因?yàn)槟0錎NA中的雜質(zhì)會(huì)抑制Taq酶活性,適當(dāng)稀釋會(huì)減少雜質(zhì)對(duì)Taq酶活性的抑制[13].研究中適宜的模板DNA用量為1 ng.

    (2) 實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),Taq酶用量對(duì)擴(kuò)增效果影響很大.當(dāng)Taq酶用量過低時(shí),催化能力弱,產(chǎn)物的合成量低,條帶淺;當(dāng)Taq酶用量過高時(shí),不僅增加試驗(yàn)成本,而且產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增,背景增強(qiáng),條帶模糊,甚至無擴(kuò)增.

    (3) dNTPs濃度太高容易產(chǎn)生錯(cuò)配,增加非特異性擴(kuò)增;濃度太低擴(kuò)增效率低,甚至?xí)驗(yàn)閐NTPs的過早消耗完畢,而使擴(kuò)增產(chǎn)物單鏈化,影響擴(kuò)增效果[14].文中dNTPs的濃度小于0.10 mmol/L 時(shí)擴(kuò)增條帶較弱,當(dāng)濃度大于0.20 mmol/L時(shí)又出現(xiàn)非特異擴(kuò)增,且部分特異性擴(kuò)增條帶丟失.

    (4) 當(dāng)引物濃度過高時(shí),易引入堿基錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增,還會(huì)形成引物二聚體;當(dāng)引物濃度過低時(shí),與模板結(jié)合效率低,產(chǎn)量下降,并有可能出現(xiàn)涂抹現(xiàn)象[15].文中引物濃度對(duì)結(jié)果影響較為明顯,濃度太低不能進(jìn)行有效的擴(kuò)增,濃度太高會(huì)條帶不穩(wěn)定及清晰度下降.這與其他植物研究結(jié)果較為一致.

    (5) 延伸時(shí)間過短,產(chǎn)物得不到有效擴(kuò)增;延伸時(shí)間過長(zhǎng),易產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增.研究中選用的幾個(gè)延伸時(shí)間梯度都比較長(zhǎng),基本都能滿足擴(kuò)增的需要,延長(zhǎng)延伸時(shí)間對(duì)長(zhǎng)片段的擴(kuò)增有利,但是在該研究中幾個(gè)長(zhǎng)片段的擴(kuò)增效果不明顯,對(duì)結(jié)果幾乎無影響.

    (6) 循環(huán)數(shù)對(duì)結(jié)果影響較顯著,循環(huán)數(shù)不足,幾乎沒有擴(kuò)增;循環(huán)數(shù)過多,又會(huì)丟失大部分特異性擴(kuò)增的大片段.可能是過多的循環(huán)數(shù)使Taq酶活性減弱,擴(kuò)增速度減慢,在一定的延伸時(shí)間內(nèi),只能完成中小片的擴(kuò)增,不能完成較大片段的擴(kuò)增.

    考慮ISSR-PCR主要反應(yīng)參數(shù)間的交互作用[16],在單因素的試驗(yàn)基礎(chǔ)上,進(jìn)一步作正交試驗(yàn).考慮到愛玉模板濃度對(duì)結(jié)果影響最小,模板濃度范圍較寬,為減少工作量,正交試驗(yàn)中就不再對(duì)模板濃度進(jìn)行優(yōu)化.正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)是從多個(gè)因子中挑選出有代表性的水平組合進(jìn)行實(shí)驗(yàn),相對(duì)于多因子的完全組合設(shè)計(jì)大大減少了工作量,以最少的處理組合,獲得最優(yōu)體系[17].由于文中對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果的評(píng)分主要依靠主觀判斷,存在一定的主觀性,因此需要檢測(cè)優(yōu)化體系的適用性和穩(wěn)定性.

    該實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后的ISSR反應(yīng)體系在14份愛玉材料中都能擴(kuò)增出穩(wěn)定清晰,多態(tài)性高的條帶.因此,建立的愛玉ISSR-PCR 反應(yīng)體系穩(wěn)定可靠,適用于其他ISSR引物和所有愛玉種質(zhì),可以為后續(xù)應(yīng)用ISSR標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行愛玉種質(zhì)遺傳多樣性分析、品種鑒定和引種等工作奠定研究基礎(chǔ).

    [1] ZIET K E,RAFAL S A,LABUDA D.Genome Fingerprinting by Simple Sequence Repeat (SSR) Anchored Polymerase Chain Reaction Amplification[J].Genomes,1994,20(2):176-183.

    [2] 張春平,何 平,王瑞波,等.三角葉黃連ISSR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化[J].中草藥,2009,40(2):282-284.

    [3] 王心宇,陳佩度,亓增軍,等.ISSR標(biāo)記在小麥指紋圖譜分析中的應(yīng)用研究初探[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2001,9(3):261-263.

    [4] 何正文,劉運(yùn)生,陳立華,等.正交設(shè)計(jì)直觀分析法優(yōu)化PCR條件[J].湖南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),1998,23(4):403-404.

    [5] LIU Guifeng,DONG Jingxiang,JIANG Ying,et al.Analysis of Genetic Relationship in 12 Species of Section Strobus with ISSR Markers[J].Journal of Forestry Research,2005,16(3):213-215.

    [6] 房志超,黃建峰,高愛平.芒果ISSR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化[J].熱帶作物學(xué)報(bào),2001,32(2):203-207.

    [7] 歐立軍,顏 旺,廖亞西,等.天門冬ISSR分子標(biāo)記技術(shù)的建立與體系優(yōu)化[J].中草藥,2001,24(2):353-357.

    [8] 歐文軍,李開綿,王文泉.小桐子基因組DNA的提取及ISSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào),2008,24(5):409-413.

    [9] 盧圣棟.現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].第2版.北京:中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社,1999:458-463.

    [10] 周延清.DNA分子標(biāo)記技術(shù)在植物研究中的應(yīng)用[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005:143-146.

    [11] 趙依杰,王江波,張小紅,等.枇杷ISSR擴(kuò)增反應(yīng)體系的優(yōu)化[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào),2010,26(7):26-30.

    [12] 吳文珊,朱曉東,鄭翠芳,等.愛玉子基因組DNA的提取和質(zhì)量分析[J].福建林業(yè)科技,2008,35(3):48-50.

    [13] 趙 謙,杜 虹,莊東紅.ISSR分子標(biāo)記及其在植物研究中的應(yīng)用[J].分子植物育種,2007,6(5):123-129.

    [14] 余 艷,陳海山,葛學(xué)軍.簡(jiǎn)單重復(fù)序列區(qū)間(ISSR)引物反應(yīng)條件優(yōu)化與篩選[J].熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào),2003,11(1):15-19.

    [15] BRUNO W S.High Output Genetic Mapping of Polyploids Using Pcr-Generated Markers[J].Theoretical and Applied Genetics,1993,86:105-112.

    [16] 潘 坤,王文泉,吳 翼,等.椰子ISSR體系優(yōu)化[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào),2009,25(4):24-29.

    [17] 張永春,湯庚國,褚云霞,等.彩色馬蹄蓮ISSR體系的建立及初步分析[J].分子植物育種,2009,7(4):827-832.

    (責(zé)任編輯 易必武)

    EstablishmentandOptimizationofISSRReactionSystemforFicusPumilaL.var.Awkeotsang

    SHI Hui1,2,HUANG Qimei1,YE Meina1,RUAN Shaojiang1,2,CHEN Yong1,2

    (1.Department of Biology,Ningde Normal University,Ningde Fujian 352100,China;2.Fujian Provinces University Project Research Center of Biological Resources with Mingdong’s Unique Feature,Ningde 352100,Fujiang China)

    The factors affecting the ISSR-PCR amplification onFicuspumilaL. var.awkeotsangsuch as dosage of template DNA,Taq DNA polymerase,dNTPs,primers and extension time and cycle times were optimized through the combination of single factor and orthogonal design experiment.The results showed that the optimal reaction system for ISSR-PCR of Ficus pumila were as follows:In the 20 μL reaction volume,1ng template DNA,1.0U Taq DNA polymerase,0.4 μmol/L primers,0.18 mmol/L dNTPs.The optimal PCR amplification process was:4 minutes at 94 ℃ for predenaturation,then followed by 35 cycles,each with 45 seconds at 94 ℃ for denaturation,45 seconds at 53 ℃ for annealing,2 at 72 ℃ for extension,finally extension at 72 ℃ for 7 minutes and holding the samples at 4 ℃.The system was applied in the amplification of 14 varieties of indicated the suitability and stability of the system.

    FicuspumilaL. var.awkeotsang;inter-simple sequence repeat(ISSR);reaction system;orthogonal design

    1007-2985(2014)02-0073-06

    2013-12-26

    寧德師范學(xué)院“服務(wù)海西建設(shè)”資助項(xiàng)目(2010H309);福建省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2006JA0399);福建省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃資助項(xiàng)目(201310398019)

    史 輝(1979-),男,安徽淮北人,寧德師范學(xué)院生物系副教授,碩士,主要從事作物遺傳育種教學(xué)研究

    陳 勇(1954-),男,江蘇南京人,寧德師范學(xué)院生物系教授,主要從事植物分類教學(xué)研究

    S667

    A

    10.3969/j.issn.1007-2985.2014.02.017

    猜你喜歡
    條帶用量引物
    2021年日本鈦加工材在各個(gè)領(lǐng)域用量統(tǒng)計(jì)
    DNA引物合成起始的分子基礎(chǔ)
    高中生物學(xué)PCR技術(shù)中“引物”相關(guān)問題歸類分析
    SSR-based hybrid identification, genetic analyses and fingerprint development of hybridization progenies from sympodial bamboo (Bambusoideae, Poaceae)
    大豆種植意向增加16.4%化肥用量或?qū)p少
    Side force controlon slender body by self-excited oscillation flag
    基于條帶模式GEOSAR-TOPS模式UAVSAR的雙基成像算法
    火炬松SSR-PCR反應(yīng)體系的建立及引物篩選
    農(nóng)戶如何稱取和配制小用量固體農(nóng)藥
    人間(2015年11期)2016-01-09 13:12:58
    基于 Savitzky-Golay 加權(quán)擬合的紅外圖像非均勻性條帶校正方法
    在线观看舔阴道视频| 十八禁网站免费在线| 在线播放无遮挡| 国产97色在线日韩免费| 18禁美女被吸乳视频| 国产高清激情床上av| 女同久久另类99精品国产91| 男女那种视频在线观看| 男人和女人高潮做爰伦理| 国产三级黄色录像| 欧美日本亚洲视频在线播放| 一个人看视频在线观看www免费 | 欧美又色又爽又黄视频| 日韩精品中文字幕看吧| 免费av观看视频| 国产伦精品一区二区三区四那| 精品久久久久久成人av| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美 | 亚洲精品粉嫩美女一区| 观看美女的网站| 十八禁人妻一区二区| 成年人黄色毛片网站| 最近在线观看免费完整版| 国产亚洲精品久久久com| 在线观看日韩欧美| 久99久视频精品免费| 九九热线精品视视频播放| 18禁在线播放成人免费| 黄片大片在线免费观看| 免费在线观看成人毛片| 级片在线观看| 国产精品99久久久久久久久| 无限看片的www在线观看| 亚洲一区二区三区不卡视频| 黄色日韩在线| 一级黄色大片毛片| 动漫黄色视频在线观看| 日韩欧美 国产精品| 日本五十路高清| 成人av一区二区三区在线看| 久久精品人妻少妇| 日本免费一区二区三区高清不卡| 人人妻人人澡欧美一区二区| 色综合亚洲欧美另类图片| 99久久无色码亚洲精品果冻| 午夜久久久久精精品| av福利片在线观看| 男女床上黄色一级片免费看| 一本一本综合久久| 看片在线看免费视频| 91久久精品电影网| 中文字幕熟女人妻在线| 美女高潮的动态| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| av中文乱码字幕在线| 最近视频中文字幕2019在线8| 黄色片一级片一级黄色片| 国产欧美日韩精品一区二区| 免费看a级黄色片| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 老司机福利观看| 内射极品少妇av片p| 亚洲成人精品中文字幕电影| 老鸭窝网址在线观看| 欧美中文综合在线视频| 国产极品精品免费视频能看的| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 久久午夜亚洲精品久久| 亚洲国产欧美网| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 亚洲七黄色美女视频| 精品午夜福利视频在线观看一区| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 波多野结衣高清作品| 久9热在线精品视频| 成人一区二区视频在线观看| 亚洲美女黄片视频| 色精品久久人妻99蜜桃| 亚洲天堂国产精品一区在线| 12—13女人毛片做爰片一| 少妇的逼好多水| 麻豆成人午夜福利视频| 欧美日韩国产亚洲二区| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 午夜福利在线观看吧| 级片在线观看| 欧美+亚洲+日韩+国产| 中文字幕熟女人妻在线| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| av福利片在线观看| 国产亚洲欧美在线一区二区| 国产精品久久久久久久久免 | 岛国在线观看网站| 91麻豆精品激情在线观看国产| 青草久久国产| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 国产高清videossex| 女同久久另类99精品国产91| 90打野战视频偷拍视频| 成熟少妇高潮喷水视频| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 嫩草影院精品99| 最新在线观看一区二区三区| 在线观看66精品国产| 国产精品免费一区二区三区在线| 日韩有码中文字幕| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 最新中文字幕久久久久| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 成熟少妇高潮喷水视频| 九九在线视频观看精品| 久久久国产精品麻豆| 色视频www国产| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 久久精品国产清高在天天线| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 91九色精品人成在线观看| 国产成人系列免费观看| 一本久久中文字幕| 国产午夜精品论理片| 精品久久久久久,| 亚洲国产精品成人综合色| 亚洲精品乱码久久久v下载方式 | 欧美一级毛片孕妇| 黄色日韩在线| 国产精品日韩av在线免费观看| 桃色一区二区三区在线观看| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 天堂动漫精品| 老司机午夜福利在线观看视频| 免费无遮挡裸体视频| 国产精品一及| 黄色片一级片一级黄色片| 又黄又粗又硬又大视频| 在线免费观看的www视频| 日韩有码中文字幕| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 国产精品免费一区二区三区在线| 欧美zozozo另类| 亚洲av一区综合| 成熟少妇高潮喷水视频| 91久久精品电影网| 成人午夜高清在线视频| 日日夜夜操网爽| 免费看a级黄色片| 老鸭窝网址在线观看| 久久久精品大字幕| 五月伊人婷婷丁香| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 亚洲成av人片在线播放无| 精华霜和精华液先用哪个| 午夜老司机福利剧场| 久久久精品大字幕| 在线观看一区二区三区| 99在线视频只有这里精品首页| 91九色精品人成在线观看| 热99在线观看视频| 三级毛片av免费| 成人国产综合亚洲| 丰满乱子伦码专区| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美 | 欧美成人免费av一区二区三区| 国产视频一区二区在线看| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 又爽又黄无遮挡网站| 在线观看66精品国产| 国产黄a三级三级三级人| 成年免费大片在线观看| 身体一侧抽搐| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 最新美女视频免费是黄的| 在线观看av片永久免费下载| 最近最新免费中文字幕在线| 99精品在免费线老司机午夜| www.色视频.com| 最近在线观看免费完整版| 国产午夜精品论理片| 精品国产美女av久久久久小说| 成人性生交大片免费视频hd| 国产精品1区2区在线观看.| 国产欧美日韩精品亚洲av| 欧美丝袜亚洲另类 | 欧美绝顶高潮抽搐喷水| www.999成人在线观看| 首页视频小说图片口味搜索| 成人av一区二区三区在线看| 中国美女看黄片| 人人妻人人看人人澡| 男人舔女人下体高潮全视频| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 99久久九九国产精品国产免费| 波多野结衣高清作品| 性欧美人与动物交配| 麻豆成人av在线观看| 亚洲国产欧美人成| 一本精品99久久精品77| 亚洲精品日韩av片在线观看 | 免费看光身美女| 99精品欧美一区二区三区四区| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 网址你懂的国产日韩在线| 亚洲国产欧美人成| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 91久久精品电影网| 久久久久九九精品影院| 亚洲最大成人中文| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 老司机午夜福利在线观看视频| 国产一区二区三区视频了| 18禁美女被吸乳视频| 国产成人a区在线观看| 2021天堂中文幕一二区在线观| 高清毛片免费观看视频网站| 日韩精品中文字幕看吧| 国产精品精品国产色婷婷| 日韩欧美国产在线观看| 在线观看一区二区三区| 美女高潮的动态| 国产一级毛片七仙女欲春2| 免费观看人在逋| 日本一本二区三区精品| 男女下面进入的视频免费午夜| 日韩有码中文字幕| 成年女人看的毛片在线观看| 夜夜爽天天搞| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 久久久久久久午夜电影| 一本精品99久久精品77| 男人舔女人下体高潮全视频| 日本黄色片子视频| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 69av精品久久久久久| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 91麻豆精品激情在线观看国产| 成年免费大片在线观看| 嫩草影视91久久| 一边摸一边抽搐一进一小说| 99久久九九国产精品国产免费| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 国产精品 欧美亚洲| 午夜福利在线在线| 国产美女午夜福利| 亚洲成人久久性| 精品久久久久久久末码| www日本在线高清视频| 国产国拍精品亚洲av在线观看 | 2021天堂中文幕一二区在线观| 国产亚洲精品久久久com| 国内精品一区二区在线观看| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 国产精品野战在线观看| 十八禁网站免费在线| 神马国产精品三级电影在线观看| 男插女下体视频免费在线播放| 日本熟妇午夜| 18禁在线播放成人免费| 久久久久久久久中文| 免费电影在线观看免费观看| 美女高潮的动态| 中文字幕久久专区| 1000部很黄的大片| 亚洲精品色激情综合| 性色avwww在线观看| 中文资源天堂在线| 成人特级av手机在线观看| 午夜久久久久精精品| 搡老岳熟女国产| 亚洲人与动物交配视频| 悠悠久久av| 亚洲五月天丁香| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 99在线人妻在线中文字幕| 久久久久精品国产欧美久久久| 日韩欧美国产一区二区入口| 亚洲成人久久爱视频| 全区人妻精品视频| 天天躁日日操中文字幕| 国内精品一区二区在线观看| 一个人免费在线观看电影| 国产色婷婷99| 久久久久久久久久黄片| 日韩欧美国产在线观看| www.色视频.com| 中出人妻视频一区二区| 少妇人妻一区二区三区视频| 美女高潮的动态| 在线观看av片永久免费下载| 精品熟女少妇八av免费久了| av在线蜜桃| 欧美zozozo另类| av黄色大香蕉| 97碰自拍视频| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 免费av毛片视频| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 欧美日本亚洲视频在线播放| 两人在一起打扑克的视频| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 麻豆国产av国片精品| 一级黄色大片毛片| 免费看十八禁软件| 欧美日韩综合久久久久久 | eeuss影院久久| 免费在线观看成人毛片| 国产精品影院久久| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 久久香蕉精品热| 欧美激情在线99| 亚洲成av人片在线播放无| 床上黄色一级片| 亚洲在线自拍视频| 十八禁网站免费在线| 国产综合懂色| 久久久久久久久久黄片| 精品久久久久久久久久免费视频| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 精品日产1卡2卡| 亚洲精品一区av在线观看| bbb黄色大片| 999久久久精品免费观看国产| 最近最新免费中文字幕在线| 一级黄色大片毛片| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 手机成人av网站| 日本a在线网址| 搡老熟女国产l中国老女人| 久久久国产精品麻豆| 国产激情欧美一区二区| 波多野结衣高清作品| 久久人妻av系列| 婷婷六月久久综合丁香| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 他把我摸到了高潮在线观看| 欧美大码av| www.色视频.com| 亚洲国产精品久久男人天堂| 久久99热这里只有精品18| 成人亚洲精品av一区二区| 欧美av亚洲av综合av国产av| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| av天堂在线播放| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 国产一区二区三区视频了| 久久性视频一级片| 国产99白浆流出| 禁无遮挡网站| 国产99白浆流出| 青草久久国产| 国产高潮美女av| 最近在线观看免费完整版| 999久久久精品免费观看国产| 桃红色精品国产亚洲av| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 怎么达到女性高潮| 国产成人福利小说| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 一个人免费在线观看的高清视频| 搡老熟女国产l中国老女人| 天天添夜夜摸| 国产探花极品一区二区| 岛国在线免费视频观看| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 性色av乱码一区二区三区2| 亚洲一区二区三区不卡视频| 狠狠狠狠99中文字幕| 天天一区二区日本电影三级| 91久久精品国产一区二区成人 | 在线观看美女被高潮喷水网站 | 亚洲成人免费电影在线观看| 桃红色精品国产亚洲av| 两个人的视频大全免费| 女警被强在线播放| 亚洲精品在线观看二区| 久久草成人影院| 成人三级黄色视频| 午夜福利成人在线免费观看| 国产伦精品一区二区三区视频9 | 3wmmmm亚洲av在线观看| 国产久久久一区二区三区| 国产主播在线观看一区二区| 久久久久精品国产欧美久久久| 欧美午夜高清在线| 国产精品一区二区免费欧美| 一二三四社区在线视频社区8| 久久国产精品人妻蜜桃| 男人舔女人下体高潮全视频| 国产麻豆成人av免费视频| 国产淫片久久久久久久久 | 听说在线观看完整版免费高清| 免费观看精品视频网站| 色吧在线观看| 在线播放国产精品三级| avwww免费| 两人在一起打扑克的视频| 麻豆成人av在线观看| 舔av片在线| 美女高潮的动态| 少妇高潮的动态图| 一区福利在线观看| 日本一二三区视频观看| 9191精品国产免费久久| 岛国视频午夜一区免费看| 国产精品久久久久久久久免 | 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 精品久久久久久久久久久久久| 欧美日本亚洲视频在线播放| 久久久国产成人免费| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 日韩欧美免费精品| 午夜视频国产福利| 99热只有精品国产| 亚洲男人的天堂狠狠| av中文乱码字幕在线| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 一级黄色大片毛片| 成人午夜高清在线视频| 国产伦在线观看视频一区| 国产一区二区在线av高清观看| 亚洲avbb在线观看| 亚洲美女黄片视频| 99精品在免费线老司机午夜| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 在线国产一区二区在线| 少妇裸体淫交视频免费看高清| www日本在线高清视频| 中亚洲国语对白在线视频| 欧美区成人在线视频| 久久午夜亚洲精品久久| 此物有八面人人有两片| 91麻豆av在线| 欧美午夜高清在线| 丁香六月欧美| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 少妇高潮的动态图| 亚洲成av人片免费观看| 国产三级中文精品| 亚洲av电影不卡..在线观看| 色吧在线观看| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 女同久久另类99精品国产91| 国产三级中文精品| e午夜精品久久久久久久| 91av网一区二区| www.熟女人妻精品国产| 亚洲熟妇熟女久久| 中文资源天堂在线| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 精品不卡国产一区二区三区| 熟女人妻精品中文字幕| 日韩人妻高清精品专区| 麻豆国产av国片精品| 12—13女人毛片做爰片一| 国产日本99.免费观看| 久久久久久人人人人人| 久久久国产成人免费| 国产乱人视频| 中出人妻视频一区二区| 亚洲,欧美精品.| a级一级毛片免费在线观看| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 老熟妇仑乱视频hdxx| 日本黄色片子视频| 免费av毛片视频| 国产激情欧美一区二区| 18禁美女被吸乳视频| 在线观看免费视频日本深夜| 国产美女午夜福利| 午夜福利欧美成人| 午夜精品一区二区三区免费看| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 日日夜夜操网爽| 九九热线精品视视频播放| 国产精品乱码一区二三区的特点| 禁无遮挡网站| 人人妻人人澡欧美一区二区| www.熟女人妻精品国产| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 欧美成人a在线观看| 欧美日韩黄片免| 亚洲成a人片在线一区二区| 亚洲片人在线观看| 中文字幕久久专区| 51午夜福利影视在线观看| 国产老妇女一区| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 久久精品国产自在天天线| 日本一本二区三区精品| 国产精品女同一区二区软件 | 久久精品国产亚洲av涩爱 | 啦啦啦观看免费观看视频高清| 亚洲性夜色夜夜综合| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 国产真实乱freesex| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 两个人看的免费小视频| 天天添夜夜摸| 国产老妇女一区| 在线免费观看不下载黄p国产 | 在线视频色国产色| 黑人欧美特级aaaaaa片| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 麻豆成人av在线观看| 三级毛片av免费| 精品国产三级普通话版| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 精品一区二区三区人妻视频| 国内精品久久久久久久电影| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 美女被艹到高潮喷水动态| 最近最新中文字幕大全免费视频| 亚洲成人久久性| 欧美一级毛片孕妇| 天堂√8在线中文| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| tocl精华| eeuss影院久久| 脱女人内裤的视频| 成人午夜高清在线视频| 老熟妇仑乱视频hdxx| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 变态另类丝袜制服| 99久久九九国产精品国产免费| 99精品久久久久人妻精品| 午夜福利欧美成人| 免费一级毛片在线播放高清视频| 欧美zozozo另类| ponron亚洲| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 国产私拍福利视频在线观看| 91九色精品人成在线观看| 一本久久中文字幕| 亚洲欧美日韩无卡精品| 怎么达到女性高潮| 久久久久久久精品吃奶| 大型黄色视频在线免费观看| 亚洲第一电影网av| 黄色视频,在线免费观看| 亚洲成人免费电影在线观看| 性欧美人与动物交配| 日本精品一区二区三区蜜桃| 国产精品乱码一区二三区的特点| 午夜精品久久久久久毛片777| 国产一区二区在线观看日韩 | 日韩欧美三级三区| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 1024手机看黄色片| 在线观看一区二区三区| 中文字幕av在线有码专区| 成人无遮挡网站| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 天堂影院成人在线观看| 俄罗斯特黄特色一大片| 亚洲精品在线美女| 色综合欧美亚洲国产小说| 老汉色av国产亚洲站长工具| 少妇高潮的动态图| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 国产精品一及| 日韩国内少妇激情av| 成人性生交大片免费视频hd| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 亚洲色图av天堂| 国产中年淑女户外野战色| 宅男免费午夜| 日韩国内少妇激情av| 亚洲人成电影免费在线| 免费av毛片视频| 国产精品99久久久久久久久| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 亚洲美女视频黄频| 99久久99久久久精品蜜桃| 禁无遮挡网站| 一a级毛片在线观看| 国产激情欧美一区二区| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 国产三级在线视频| 中文字幕久久专区| 亚洲精华国产精华精| 国产野战对白在线观看| 亚洲av不卡在线观看| 亚洲,欧美精品.| 国产伦精品一区二区三区四那| 偷拍熟女少妇极品色| 国产精品乱码一区二三区的特点| 亚洲七黄色美女视频| 激情在线观看视频在线高清| 亚洲成av人片免费观看| av中文乱码字幕在线| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 精品国产三级普通话版| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 国产一区二区三区在线臀色熟女| 欧美乱色亚洲激情| 国产精品久久视频播放| 色哟哟哟哟哟哟| 色视频www国产| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 午夜精品一区二区三区免费看| 舔av片在线| h日本视频在线播放| 欧美色视频一区免费| 2021天堂中文幕一二区在线观| 日韩欧美在线二视频| 哪里可以看免费的av片| 久久久久免费精品人妻一区二区| 日本 欧美在线| 国产爱豆传媒在线观看|