玉米愈傷組織對除草劑的敏感性*

王紅濤，徐 紅，李艷臣

(通化師范學院 生命科學學院，吉林 通化 134002)

玉米是世界第三大糧食作物，其種植面積僅次于水稻和小麥，也是制藥、淀粉、飲料、糖精和酒精工業(yè)的重要原料．玉米的品種改良現(xiàn)多集中于品質(zhì)改良及各種抗性的研究，是進行生物技術(shù)研究和創(chuàng)新玉米品種資源的一個良好試驗系統(tǒng).本實驗通過采用抗除草劑玉米自交系H99的胚性愈傷組織為材料，通過愈傷組織對Basta的敏感性實驗，確定愈傷組織適宜的篩選濃度，并初步確定低濃度除草劑對愈傷組織增長有促進作用，高濃度具有抑制作用．通過本課題研究，可為玉米農(nóng)作物的合理開發(fā)應用提供依據(jù)，另外為其新品種的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)．

1 實驗材料

1.1 供試材料

H99玉米外植體

1.2 培養(yǎng)基

MS、N6、B5、MB、NB、NMB

1.3 實驗試劑

除草劑、酒精、次氯酸鈉、無菌水

1.4 實驗儀器

超凈工作臺、冰箱、溫度計、酸度計、分析天平、高壓鍋、酒精燈 試管、容量瓶、移液管等.

2 實驗方法

2.1 培養(yǎng)基的選擇

將授粉10～14d的H99玉米幼胚分別接種于Ms，N6，B5，MB，NB，NMB六種誘導培養(yǎng)基中，20d后觀察愈傷組織誘導情況，此時多為I型愈傷組織，統(tǒng)計愈傷組織誘導率．計算公式為：愈傷組織誘導率=產(chǎn)生愈傷組織的量/接種總量．

2.2 玉米胚性愈傷組織的誘導

幼胚接種方法是取授粉后11～14d的H99外植體幼穗，將其撥去最外層數(shù)片苞葉，留3～5個苞葉，切去雌果穗頭部無籽粒部分，幼胚長0.8～3.0mm在超凈工作臺上用75%酒精浸泡5～10min后移入5%次氯酸鈉溶液浸泡15～20min，然后用無菌水沖洗3～4次，挑出幼胚長度在1.5mm左右的幼胚接到培養(yǎng)基上，在暗室中培養(yǎng)三周左右產(chǎn)生I型初始愈傷組織，溫度26±1℃，觀察愈傷組織誘導狀況并統(tǒng)計愈傷組織誘導率，每隔20d繼代1次，繼代1～2次后即產(chǎn)生穩(wěn)定的Ⅱ型愈傷組織，取繼代2～3次的Ⅱ型愈傷組織作為農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的受體材料．

2.3 除草劑的配制

除草劑Basta的原始濃度為13.5g·100mL-1取出2.22mL加47.7mL水稀釋、抽濾滅菌得到6mg·L-1的除草劑母液濃度，在13個含有100mL培養(yǎng)基的錐形瓶中加入0、17、34、51、68、85、102、119、136、153、170、187、204μL的母液得到除草劑濃度分別為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12mg·L-1的篩選培養(yǎng)基．

2.4 愈傷組織的繼代培養(yǎng)

在無菌工作臺上將誘導出的生長旺盛、質(zhì)地緊密、顏色鮮艷的玉米Ⅱ型愈傷組織用鑷子分散為2～3mm左右的愈傷組織塊，接種于培養(yǎng)皿中，并用電子天平稱量所接愈傷組織的重量，培養(yǎng)兩周后，稱量愈傷組織的重量，計算愈傷組織的增殖指數(shù)．

3 結(jié)果與分析

3.1 不同培養(yǎng)基對H99玉米愈傷組織誘導的影響

在玉米胚性愈傷組織的獲得中，培養(yǎng)基的選擇尤為重要，只有使培養(yǎng)基適應胚性愈傷組織的要求，才能使好的愈傷組織在長期繼代中保持良好的胚性狀態(tài)，從而減少無性系變異并保持較好的胚性．本實驗采用不同培養(yǎng)基對愈傷組織進行誘導，經(jīng)計算得出結(jié)論：N6培養(yǎng)基的胚性愈傷組織誘導率最高．

3.2 玉米愈傷組織對Basta敏感性的測定

將H99的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)接于不同濃度的含Basta的篩選繼代培養(yǎng)基上，26℃培養(yǎng)20d后觀察愈傷組織褐變情況，各設置4次重復，統(tǒng)計結(jié)果見表1和圖1．

表1 除草劑濃度對H99愈傷組織褐變率的影響

圖1 愈傷組織篩選率曲線

3.3 除草劑濃度對H99玉米愈傷組織重量增長

將H99的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)接于不同濃度的含Basta的篩選繼代培養(yǎng)基上，26℃培養(yǎng)20天后觀察愈傷組織重量增重情況，各設置4次重復，統(tǒng)計結(jié)果見表2．

表1和表2未轉(zhuǎn)化的試驗結(jié)果表明8mg/L的除草劑為梯度篩選濃度．不同Basta濃度下玉米愈傷組織中的積累和組織的增重在加有除草劑的培養(yǎng)基上，隨著除草劑的濃度增大，愈傷組織生長速率明顯下降，愈傷組織褐變率也相應增高，增重指數(shù)呈下降趨勢；當Basta濃度為8mg/L時，玉米愈傷組織的重量增長率隨培養(yǎng)基中Basta濃度增加而降低，濃度高于8mg/L時對玉米愈傷組織的分化具有明顯的抑制作用；當Basta濃度為10mg/L、11mg/L及12mg/L時，觀察到大多數(shù)愈傷組織已經(jīng)變褐死亡，重量不再增加．存活的愈傷組織生長較緩慢，部分喪失胚性．試驗中還發(fā)現(xiàn)，不同生理狀態(tài)下的組織對Basta除草劑的敏感性也不同，生長狀態(tài)較好時，耐受性較強，反之較弱．

表2 除草劑濃度對H99玉米愈傷組織重量增長的影響

4 討論

綜上得出，N6培養(yǎng)基的愈傷誘導率和胚性愈傷誘導率最高，并且愈傷組織鮮黃色或淺黃色，愈傷組織表現(xiàn)良好的胚性;其次是NB， MB和Ms培養(yǎng)基，胚性愈傷誘導率也較高，愈傷組織誘導效果最差的是NMB培養(yǎng)基，不但愈傷組織誘導率較低，而且愈傷組織多為水漬狀，并且多褐變．另外影響愈傷組織的誘導因素還有3點：①材料的遺傳基礎(chǔ)或稱基因型的差異；②培養(yǎng)基培養(yǎng)條件、培養(yǎng)方式等外部條件；③外植體的生理條件狀態(tài)和發(fā)育時期論．