IKBKB在人肺腺癌細(xì)胞株A549及其耐藥細(xì)胞株A549/DDP中的表達(dá)和意義

齊康 李洋 李雪冰 張芳 邵宜 周清華

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，其死亡率占全球所有男性腫瘤患者死亡人數(shù)的28%，女性腫瘤患者死亡人數(shù)的26%[1]。其中非小細(xì)胞肺癌占到了肺癌總數(shù)的80%[2]?；熓欠伟┚C合治療方案的重要組成部分，由于近些年化療方案的不斷改善，肺癌患者生存率已得到明顯提升，但是腫瘤細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生嚴(yán)重影響了化療的療效。順鉑是肺癌化療方案中最常應(yīng)用的藥物之一[3]，但是在臨床治療過程中順鉑耐藥現(xiàn)象廣泛存在。因此，研究順鉑耐藥機(jī)制對(duì)探索研發(fā)克服耐藥產(chǎn)生的新化療藥物有重要意義。通過研究發(fā)現(xiàn)，順鉑耐藥機(jī)制主要包括DNA損傷修復(fù)能力增強(qiáng)、細(xì)胞周期的調(diào)控、細(xì)胞解毒功能增強(qiáng)及細(xì)胞凋亡的抑制等[4-6]。

IKBKB（又名為IKKβ）是IKK復(fù)合物重要的催化亞基，它與催化亞基IKKα以及調(diào)節(jié)亞基IKKγ共同構(gòu)成IKK復(fù)合物。IKK復(fù)合物的磷酸化可以激活NF-κB，使得NF-κB轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)調(diào)控一系列基因表達(dá)[7,8]。在組成IKK復(fù)合物的催化亞基中，IKBKB在激活NF-κB方面起到最重要的作用[9]。最近研究[10,11]發(fā)現(xiàn)，IKBKB在乳腺癌和頭頸部鱗癌順鉑耐藥產(chǎn)生中起重要作用。然而，IKBKB在肺癌順鉑耐藥性產(chǎn)生的作用中罕有報(bào)道。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)IKBKB基因高表達(dá)可以導(dǎo)致肺腺癌細(xì)胞順鉑耐藥性增加并抑制細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示IKBKB基因在肺癌順鉑耐藥過程中發(fā)揮重要作用，該基因主要通過激活NF-κB信號(hào)通路抑制細(xì)胞凋亡導(dǎo)致耐藥。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器 本實(shí)驗(yàn)采用人肺癌腺A549癌細(xì)胞系及人肺腺癌順鉑耐藥細(xì)胞系A(chǔ)549/DDP由天津市肺癌研究所提供；順鉑、噻唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）購自Sigma；細(xì)胞培養(yǎng)基PRMI-1640購自GIBCO；質(zhì)粒小提試劑盒及膠回收試劑盒購自Axygen；質(zhì)粒表達(dá)載體3.1(+)Hygro及轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine 2000購自Invitrogen；感受態(tài)細(xì)胞（E.coli DH5α Competent Cells）；限制酶（Hind III, Xba I）、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購自Takara；細(xì)胞凋亡流式檢測試劑盒購自BD biosciences；PCR儀（Thermo）；流式細(xì)胞儀（BD）；酶標(biāo)儀（Thermo）；質(zhì)粒測序由北京華大基因公司完成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) A549及A549/DDP細(xì)胞使用含有10%小牛血清的PRMI-1640培養(yǎng)基至于37oC、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化傳代，實(shí)驗(yàn)均采用處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞。其中A549/DDP細(xì)胞在培養(yǎng)過程中置于2 μg/mL DDP中維持其耐藥性。

1.3 質(zhì)粒構(gòu)建與轉(zhuǎn)染 根據(jù)IKBKB基因CDS區(qū)設(shè)計(jì)引物序列為：上游引物：5'- AAGCTTCGACATCAGTATGAGCTG GTCACCTTCC-3'；下游引物：5'- TCTAGAAGTCCCCC CACATCATGAGGCCTGCTCC-3'；以人正常支氣管上皮細(xì)胞RNA為模板反轉(zhuǎn)錄cDNA。PCR條件：98oC、30 s，1個(gè)循環(huán)；98oC、10 s，63oC、10 s，68oC，2 min 40 s，34個(gè)循環(huán)；68oC、2 min，4oC保存。PCR產(chǎn)物電泳后膠回收并測序。IKBKB基因膠回收產(chǎn)物與pcDNA3.1空載體均用Hind III和Xba I進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物電泳回收，用T4DNA Ligase在16oC連接回收的IKBKB片段和pcDNA3.1載體。連接產(chǎn)物利用DH5α感受態(tài)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂于含氨芐青霉素（Amp）的LB瓊脂板上，37oC培養(yǎng)過夜。待LB瓊脂板長出菌落后，挑取單菌落至于液體LB培養(yǎng)基中搖菌擴(kuò)增。應(yīng)用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒并進(jìn)行酶切及測序驗(yàn)證。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將A549細(xì)胞接種到6孔板中，細(xì)胞生長達(dá)到80%融合時(shí)，根據(jù)lipofectamine 2000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.4 MTT檢測細(xì)胞耐藥 將培養(yǎng)皿中對(duì)數(shù)生長且融合度達(dá)到80%的A549細(xì)胞、A549/DDP細(xì)胞和轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/IKBKB質(zhì)粒的A549細(xì)胞及轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1質(zhì)粒的A549細(xì)胞用胰酶消化，培養(yǎng)基終止消化后制成1×104/mL單細(xì)胞懸液，加入到96孔板中，每孔180 μL。在37 °C、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，將順鉑稀釋為0、0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL、4 μg/mL、6 μg/mL、8 μg/mL、10 μg/mL、12 μg/mL、16 μg/mL、32 μg/mL的濃度梯度，每一濃度梯度設(shè)置5個(gè)附孔，并且設(shè)置空白對(duì)照空（僅有細(xì)胞）及空白孔（僅有培養(yǎng)基），72 h后每孔加入20 μL新制備的MTT（5 mg/mL）溶液，在孵箱中培養(yǎng)4 h后，吸去培養(yǎng)基，每孔加入150 μL DMSO溶液，微量振蕩器震動(dòng)10 min，應(yīng)用490 nm波長的酶標(biāo)儀（Molecular Device SPECTRA max M5, USA）測定96孔板吸光值（OD）。抑制率計(jì)算公式為：生長抑制率=（1-OD用藥組/OD對(duì)照組）×100%，以最小二乘法進(jìn)行曲線擬合，得到IC50值。

1.5 Real-time PCR檢測A549、A549/DDP、轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/IKBKB質(zhì)粒的A549細(xì)胞、轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1質(zhì)粒的A549細(xì)胞中的mRNA水平變化，以及進(jìn)一步檢測NF-κB基因mRNA水平變化 取對(duì)數(shù)生長的上述細(xì)胞，用Trizol提取各細(xì)胞系的總RNA， IKBKB上游引物: 5'-GGGAAATAACACCCGAAAG-3'；下游引物：5'-TGTAACTGAACATAAAC-3'； GAPDH上游引物：5'-T GCACCACCAACTGCTTAGC-3' ；下游引物：5'-GGCATG GACTGTGGTCATGAG-3'；反應(yīng)條件：95oC、30 s，一個(gè)循環(huán)；95oC、5 s，60oC、30 s，40個(gè)循環(huán)；95oC、15 s，60oC、1 min，95oC、15 s，一個(gè)循環(huán)。

1.6 流式細(xì)胞技術(shù) 檢測IKBKB基因在肺腺癌細(xì)胞耐藥中的作用，將對(duì)數(shù)生長的A549細(xì)胞制備成1×104/mL單細(xì)胞懸液，加入到6孔板中，每孔2 mL。在37 °C、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，根據(jù)lipofectamine 2000說明書轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/IKBKB質(zhì)粒及pcDNA3.1空載體（空載體組為對(duì)照組）。轉(zhuǎn)染后36 h后，每孔加入2.5 μg/mL濃度的順鉑，繼續(xù)孵育24 h。細(xì)胞用胰酶消化后根據(jù)說明書應(yīng)用Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒染色（Annexin V-FITC Apoptosis Analysis Kit, Pharmingen, CA），用FACSAriaTM流式細(xì)胞儀（BD Bioscience, CA）檢測染色細(xì)胞，以轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載體的A549細(xì)胞為對(duì)照組，WIMDI 2.8軟件進(jìn)行分析。

1.7 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 從碧云天公司購買檢測轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活性的報(bào)告基因質(zhì)粒，同時(shí)用Renilla質(zhì)粒作為內(nèi)參進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。在A549細(xì)胞中轉(zhuǎn)染NF-κB-luc質(zhì)粒和Renilla質(zhì)粒，在過表達(dá)IKBKB后，檢測IKBKB對(duì)NF-κB轉(zhuǎn)錄因子活性的影響。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，Excel 2003作圖。統(tǒng)計(jì)分析方法采用方差分析或t檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 檢測A549及A549/DDP細(xì)胞中IKBKB基因表達(dá)差異及兩細(xì)胞株之間凋亡和藥物敏感性差異 本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用realtime PCR技術(shù)檢測IKBKB基因在兩親本細(xì)胞系中的mRNA表達(dá)水平差異，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示IKBKB基因在A549/DDP細(xì)胞株中高表達(dá)，表達(dá)量為A549細(xì)胞的1.9倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖1A）。應(yīng)用MTT檢測藥物敏感性，A549及A549/DDP細(xì)胞在順鉑作用下的IC50值分別為（2.16±1.31）μg/mL、（14.32±1.18）μg/mL（P＜0.01）（圖1B）。為了檢測兩株細(xì)胞在順鉑作用下的凋亡差異，A549及A549/DDP細(xì)胞經(jīng)濃度為2.5 μg/mL順鉑處理后，通過流式細(xì)胞儀檢測顯示凋亡率分別為（15.52±1.21）% 、（7.62±0.82）%（P＜0.01）（圖1C），結(jié)果說明A549/DDP細(xì)胞耐藥性和抗凋亡性均明顯強(qiáng)于A549細(xì)胞。

2.2 pcDNA3.1/IKBKB質(zhì)粒構(gòu)建及轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1/IKBKB質(zhì)粒構(gòu)建完成后進(jìn)行酶切鑒定，瓊脂糖電泳結(jié)果顯示質(zhì)粒被酶切成兩個(gè)條帶，分別對(duì)應(yīng)marker為2,000 bp及5,000 bp（圖2），質(zhì)粒測序顯示堿基序列正確。與對(duì)照組（A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載體）和未處理的A549細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/IKBKB質(zhì)粒的A549細(xì)胞中IKBKB基因在mRNA水平明顯上升（圖3A），結(jié)果說明質(zhì)粒構(gòu)建及轉(zhuǎn)染成功。

2.3 IKBKB基因通過抑制細(xì)胞凋亡導(dǎo)致A549細(xì)胞順鉑耐藥性增加 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/IKBKB質(zhì)粒的A549細(xì)胞與對(duì)照組（A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載體）和未處理的A549細(xì)胞相比，IC50分別為（8.31±1.16）μg/mL、（2.91±0.98）μg/mL、（2.24±1.17）μg/mL（P＜0.01）（圖3B），結(jié)果表明過表達(dá)IKBKB基因的A549細(xì)胞耐藥性明顯增加；進(jìn)一步通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/IKBKB質(zhì)粒組與對(duì)照組（空載體組）和未處理組在順鉑作用下的凋亡率分別為（8.76±1.43）%、（14.69±2.01）% 、(15.89±1.61)%（P＜0.01）（圖3C），結(jié)果提示IKBKB基因通過抑制細(xì)胞凋亡導(dǎo)致順鉑耐藥。

圖1 A549與A549/DDP細(xì)胞中IKBKB基因表達(dá)差異及兩細(xì)胞株之間凋亡和藥物敏感性差異。A：Real-time PCR檢測IKBKB基因在A549與A549/DDP細(xì)胞株中的mRNA水平差異；B：MTT檢測A549與A549/DDP細(xì)胞株順鉑的敏感性；C：流式細(xì)胞技術(shù)檢測A549與A549/DDP細(xì)胞株的凋亡率；*P＜0.05；**P＜0.01.Fig 1 Detection of BRE expression and cisplatin-resistance in A549 and A549/DDP cells. A: Real-time PCR analysis of IKBKB expression in A549 and A549/DDP cells; B: MTT analysis of cell viability of A549 and A549/DDP cells after treated by cisplatin; C: Annexin V-FITC flow cytometry assay detects the apoptosis rate of A549 and A549/DDP cells after treated by cisplatin. *P＜0.05; **P＜0.01.

圖2 pcDNA3.1/IKBKB酶切產(chǎn)物的0.8%瓊脂糖凝膠電泳圖。1，2：pcDNA3.1/Hygro；3，4：pcDNA3.1/IKBKB經(jīng)酶切后片段。Fig 2 0.8% agrose gel electrophoresis of enzyme-digested products of pcDNA3.1/IKBKB; 1, 2: pcDNA3.1/Hygro; 3, 4: Enzyme-digested products of pcDNA3.1/IKBKB.

2.4 pcDNA3.1/IKBKB質(zhì)粒在A549細(xì)胞中的高表達(dá)激活NF-κB信號(hào)通路 本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了IKBKB基因?qū)е翧549細(xì)胞耐藥的分子機(jī)制，我們對(duì)IKBKB基因下游的NF-κB信號(hào)通路進(jìn)行研究。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示（圖4），在A549細(xì)胞中過表達(dá)IKBKB后，NF-κB的活性高于轉(zhuǎn)染對(duì)照空載體組，說明在肺腺癌細(xì)胞A549中，IKBKB確實(shí)可以激活下游NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性。

3 討論

順鉑耐藥的產(chǎn)生涉及復(fù)雜分子機(jī)制，其中包括染色體異常、凋亡相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、凋亡抑制因子表達(dá)、DNA損傷修復(fù)基因表達(dá)、HER-2/neu高表達(dá)、PI3K/AKT信號(hào)通路的激活、P53功能缺失、caspase激活過程的阻斷等[5,12]，但是具體腫瘤細(xì)胞順鉑耐藥性的產(chǎn)生機(jī)制尚不明確。有研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)IKBKB基因在乳腺癌和頭頸部鱗癌順鉑耐藥產(chǎn)生中起重要作用[10,11]，但是其在肺癌順鉑耐藥研究中罕有報(bào)道。

圖3 過表達(dá)IKBKB基因?qū)е翧549細(xì)胞順鉑耐藥性增加。A：Real-time PCR檢測IKBKB基因在轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/IKBKB質(zhì)粒A549細(xì)胞、轉(zhuǎn)染pcDNA3.1質(zhì)粒A549細(xì)胞、未處理A549細(xì)胞中的差異；B：MTT檢測轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/IKBKB質(zhì)粒A549細(xì)胞、轉(zhuǎn)染pcDNA3.1質(zhì)粒A549細(xì)胞、未處理A549細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性；C：流式細(xì)胞技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/IKBKB質(zhì)粒A549細(xì)胞、轉(zhuǎn)染pcDNA3.1質(zhì)粒A549細(xì)胞、未處理A549細(xì)胞順鉑作用下的凋亡率；*P＜0.05; **P＜0.01.Fig 3 Up-regulation of IKBKB expression induces cisplatin-resistance in A549 cells. A: Real-time PCR analysis of IKBKB in A549 cells transfected with pcDNA3.1 or pcDNA3.1/IKBKB and untreated A549 cells; B: MTT analysis of cell viability of A549 cells transfected with pcDNA3.1 or pcDNA3.1/IKBKB and primary A549 cells after treated by cisplatin; C: Annexin V-FITC flow cytometry assay detects the apoptosis rate of A549 cells transfected with pcDNA3.1 or pcDNA3.1/IKBKB and primary A549 cells after treated by cisplatin. **P＜0.01.

圖4 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測顯示：pcDNA3.1/IKBKB在A549細(xì)胞中激活NF-κB的活性。*P＜0.05； **P＜0.01.Fig 4 Dual luciferase reporter gene experiment: In A549 cells,pcDNA3.1/IKBKB enhances the activity of NF-κB. **P＜0.01.

IKBKB是組成IKK復(fù)合體的重要催化亞基之一，其在IKK復(fù)合體激活NF-κB過程中發(fā)揮重要作用[9]。為了研究IKBKB基因在肺癌順鉑耐藥產(chǎn)生中的作用，我們應(yīng)用real-time PCR技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)IKBKB基因在肺腺癌A549/DDP細(xì)胞株中的表達(dá)明顯高于A549細(xì)胞株，這說明IKBKB基因的高表達(dá)可能導(dǎo)致肺癌細(xì)胞順鉑耐藥性的產(chǎn)生。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，順鉑作用下的A549/DDP細(xì)胞株IC50明顯高于A549細(xì)胞株，流式細(xì)胞技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)A549/DDP細(xì)胞株凋亡率明顯低于A549細(xì)胞。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們推測，IKBKB通過抑制肺腺癌細(xì)胞株凋亡過程導(dǎo)致耐藥性增加。凋亡抑制在順鉑耐藥性產(chǎn)生的機(jī)制中起重要作用[3]，為了明確IKBKB基因通過抑制凋亡導(dǎo)致肺癌順鉑耐藥性產(chǎn)生的機(jī)制，我們通過在A549細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/IKBKB質(zhì)粒過表達(dá)了IKBKB基因。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示IKBKB高表達(dá)的A549細(xì)胞耐藥性明顯增加，凋亡受到明顯抑制，這與我們的提出的假設(shè)一致，說明IKBKB調(diào)控的凋亡抑制是肺癌產(chǎn)生順鉑耐藥的機(jī)制之一。

有研究[11]報(bào)道，IKBKB在乳腺癌中通過抑制FOXO3導(dǎo)致順鉑耐藥性產(chǎn)生。我們的研究發(fā)現(xiàn)，IKBKB基因的高表達(dá)激活了其下游的NF-κB信號(hào)通路。NF-κB是具有多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的核轉(zhuǎn)錄因子，其靜息狀態(tài)下位于細(xì)胞質(zhì)中，激活后進(jìn)入到細(xì)胞核內(nèi)調(diào)控細(xì)胞凋亡、炎癥、氧化應(yīng)激等過程。NF-κB介導(dǎo)多種凋亡相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，具有抑制細(xì)胞凋亡的作用[13]，TNFR相關(guān)因子、JNK、Bcl-2家族等都參與了NF-κB激活后的抗凋亡過程[14]。有研究顯示，NF-κB信號(hào)通路激活可以導(dǎo)致抗腫瘤藥物耐藥[15]，NF-κB信號(hào)通路的激活導(dǎo)致宮頸癌細(xì)胞產(chǎn)生順鉑耐藥[16]，抑制NF-κB信號(hào)通路可以引發(fā)耐順鉑的胃癌細(xì)胞株（SGC7901/DDP）凋亡增加，逆轉(zhuǎn)其耐藥性[17]。我們的研究顯示，IKBKB基因通過激活NF-κB信號(hào)通路抑制細(xì)胞凋亡。

本研究發(fā)現(xiàn)，IKBKB基因在細(xì)胞耐藥性產(chǎn)生的機(jī)制中起著重要的調(diào)節(jié)作用。IKBKB通過激活NF-κB信號(hào)通路抑制細(xì)胞凋亡，從而使細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性。雖然具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究，但我們的研究豐富了腫瘤耐藥性產(chǎn)生的機(jī)制，為新的抗腫瘤藥物的研發(fā)提供了新靶點(diǎn)，對(duì)解決腫瘤耐藥的難題有重要意義。