血管緊張素轉(zhuǎn)化酶性質(zhì)及膠原蛋白對(duì)其活性抑制效果的研究

李梟辰，劉 爽，鄧小霞，王子華，孫曉悅，姜宏德，吳德峰，龐 海

(1.福建農(nóng)林大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2.吉林省金梓源生物科技有限公司，吉林 雙遼136400；3.清華大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，北京 100084

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶性質(zhì)及膠原蛋白對(duì)其活性抑制效果的研究

李梟辰1,2，劉 爽2，鄧小霞2，王子華2，孫曉悅2，姜宏德1,2，吳德峰1*，龐 海3*

(1.福建農(nóng)林大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2.吉林省金梓源生物科技有限公司，吉林 雙遼136400；3.清華大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，北京 100084

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(Angiotensin Converting Enzyme,ACE)與人和動(dòng)物血壓調(diào)節(jié)密切相關(guān)，為高血壓疾病的藥物靶標(biāo)，篩選ACE抑制劑可為研制新型高血壓疾病預(yù)防藥物提供可靠的先導(dǎo)化合物。試驗(yàn)從豬肺中提取ACE，首先對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了試驗(yàn)分析，繼而考察了三個(gè)不同商品化的膠原蛋白肽對(duì)ACE抑制活性的影響。采用分光光度法，以馬尿酰-組氨酸-亮氨酸(Hip-His-Leu,HHL)為底物測(cè)定血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的活力。結(jié)果表明:血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的最適pH為8.0；最適溫度為40 ℃；350 mmol/L氯離子存在的情況下，能夠明顯提高ACE的活性；金屬離子對(duì)酶活的影響表現(xiàn)出促進(jìn)或抑制的作用。通過比較，在低溫條件下提取的自制膠原蛋白肽的ACE抑制活性要高于另外兩種商品化膠原蛋白肽產(chǎn)品。

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶；酶學(xué)性質(zhì)；膠原蛋白；抑制活性

高血壓作為一種慢性疾病，在我國(guó)乃至全球都威脅著人類的健康，并且每年其發(fā)病率都呈上升趨勢(shì)[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在2012年我國(guó)高血壓患病率約為24%[2]。作為經(jīng)常性伴有危險(xiǎn)因素的疾病，高血壓也會(huì)導(dǎo)致身體出現(xiàn)各種相關(guān)疾病，并且它是導(dǎo)致心血管疾病的主要誘因之一，其危害性可見一斑[3]。與此同時(shí)，高血壓對(duì)動(dòng)物健康也存在著很大隱患，尤其是現(xiàn)代貓犬等寵物對(duì)人們的生活越來越重要，長(zhǎng)期的養(yǎng)尊處優(yōu)并且缺少運(yùn)動(dòng)，使得他們患有高血壓等“富貴病”的幾率大大上升。

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(Angiotensin Converting Enzyme,ACE)是一種哺乳動(dòng)物組織中普遍存在的，含鋅離子的膜結(jié)合外肽酶，催化血管緊張素I(Angitensin I,A I)形成具有強(qiáng)烈收縮血管功能的血管緊張素II(Angitensin II,A II)，引起血壓升高[4]。因而，ACE在血壓的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，與高血壓的形成密切相關(guān)。因此，通過研究ACE的酶學(xué)性質(zhì)，不僅對(duì)高血壓的防治具有積極作用，并且對(duì)新型ACE抑制劑的研究和開發(fā)大有幫助。

由于化學(xué)合成的ACE抑制藥具有引發(fā)咳嗽[5]、腎功能障礙[6]等不良反應(yīng)。因此，安全且副作用低的天然ACE抑制劑日益受到人們的關(guān)注。時(shí)下熱門的膠原蛋白，廣泛地存在于動(dòng)物的結(jié)締組織中，是一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，對(duì)機(jī)體和臟器起著支持、保護(hù)等作用，也是修復(fù)各種損傷組織的重要物質(zhì)[7]。作為天然保健品的膠原蛋白，經(jīng)過研究證明具有抑制ACE活性作用[8-9]。因此，本試驗(yàn)選取三種不同產(chǎn)地的膠原蛋白，對(duì)其ACE抑制活性進(jìn)行評(píng)價(jià)和比較，以期為發(fā)掘具有ACE抑制活性以及為治療人和動(dòng)物的高血壓的膠原蛋白提供基本依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

新鮮豬肺由市場(chǎng)購(gòu)得。HHL和馬尿酸標(biāo)準(zhǔn)品 (Hippuric acid,HA)均購(gòu)自Sigma公司，硫酸銨、鹽酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、乙酸乙酯等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。自制膠原蛋白由吉林省金梓源生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，德國(guó)產(chǎn)膠原蛋白(AYMIN)和法國(guó)產(chǎn)膠原蛋白(FRANSAU)均購(gòu)自市場(chǎng)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 ACE的提取 根據(jù)參考文獻(xiàn)[10-11]的做法：取200 g新鮮豬肺，用預(yù)冷的0.9%的生理鹽水清洗，剪成小塊，除去脂肪和大血管，加入600 mL的蒸餾水，斷續(xù)勻漿10×20 s，加入15 mL的10%Triton X-100，慢速攪拌30 min，4層紗布過濾，濾液4 ℃離心(6000 g×20 min)，取上清液，1.6～2.6 mol/L硫酸銨分級(jí)沉淀，收集沉淀，再用預(yù)冷的100 mmol/L的磷酸緩沖液(含0.3 mol/L NaCl，pH8.3)溶解。離心后取上清進(jìn)行透析，再用100 KD分子量截留的超濾管，3 500 r/min離心濃縮，得ACE濃縮液。

1.2.2 HA標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 將HA標(biāo)準(zhǔn)樣品用磷酸緩沖液溶解配成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)母液。然后將標(biāo)準(zhǔn)母液稀釋成5 μg/mL、10 μg/mL、15 μg/mL、20 μg/mL、25 μg/mL、30 μg/mL、35 μg/mL系列濃度。經(jīng)0.45 μM濾膜過濾后，在228 nm下分別測(cè)定吸光值。以HA濃度為橫坐標(biāo)，其吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 ACE活性的測(cè)定 ACE活力測(cè)定參考Cushman[12]的經(jīng)典方法并稍作修改，即在37 ℃，pH8.3的條件下，ACE催化血管緊張素I的模擬物HHL產(chǎn)生HA。HA在波長(zhǎng)228 nm處具有特殊吸收峰。根據(jù)HA標(biāo)準(zhǔn)曲線上相對(duì)應(yīng)的值即可進(jìn)行活性計(jì)算。

酶活性單位定義：1單位酶活定義在37 ℃，1min內(nèi)催化HHL形成1 μmolHA的酶量。

1.2.4 ACE的酶學(xué)性質(zhì)

1.2.4.1 最適反應(yīng)pH 配制pH4.0～10.0的緩沖液，將1 μL酶液加入其中，在37 ℃下用標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定酶活，以最大酶活為100%，分別計(jì)算各pH下的相對(duì)酶活。

1.2.4.2 最適反應(yīng)溫度 在反應(yīng)體系中加入酶液(pH8.3)，在不同溫度下測(cè)定ACE的酶活。測(cè)定時(shí)間為10 min，以最大酶活為100%。分別計(jì)算各溫度下的相對(duì)酶活。

1.2.4.3 氯離子對(duì)酶活的影響 在反應(yīng)體系中加入不同濃度的氯離子，按標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定酶活。以不加任何物質(zhì)時(shí)的酶活為100%。計(jì)算在不同濃度氯離子存在情況下的相對(duì)酶活。

1.2.4.4 金屬離子對(duì)酶活的影響 在反應(yīng)體系中加入不同濃度的二價(jià)金屬離子。二價(jià)金屬離子包括：Mg2+、Fe2+、Co2+、Zn2+。以不加任何物質(zhì)時(shí)的酶活為100%。計(jì)算在不同濃度金屬離子存在情況下的相對(duì)酶活。

1.2.5 不同產(chǎn)地膠原蛋白對(duì)ACE抑制效果的比較 將三種不同產(chǎn)地的膠原蛋白用磷酸緩沖液溶解配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)母液。經(jīng)過稀釋之后配成0.01 mg/mL、0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL系列濃度后分別與先前提取的適量ACE混合，將混合物于37 ℃水浴鍋中溫浴10 min。

試驗(yàn)具體操作步驟根據(jù)參考文獻(xiàn)[13]并稍作修改：反應(yīng)的總體積為350 μL，其中含100mmol/L pH8.3磷酸緩沖液、0.3 mol/LNaCl、5 mmol/L HHL。在37 ℃恒溫水浴3 min，然后加入溫浴10 min后的混合物啟動(dòng)反應(yīng)，恒溫保持30 min后，加入250 μL 1 mol/L HCl中止反應(yīng)。再加入1.5 mL乙酸乙酯，用力混合15 s，3 500 r/min離心15 min后取出1.0 mL酯層轉(zhuǎn)入另一試管中，在120 ℃的烘箱經(jīng)30 min蒸干，再將它重新溶于1.0 mL的磷酸緩沖液中，在228 nm處測(cè)定吸光值。

抑制率的計(jì)算方法根據(jù)參考文獻(xiàn)[14]如下式計(jì)算：

Inhibition/%=(ODA-ODB)/(ODA-ODC)

式中：ODA為不存在抑制劑時(shí)的光密度；ODB為存在抑制劑與酶時(shí)的光密度；ODC為抑制劑與酶都不存在時(shí)的光密度。

對(duì)ACE抑制率達(dá)到50%時(shí)的抑制劑濃度即為半抑制濃度，記為IC50。IC50值越小，說明抑制劑活性越大。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

繪制的HA標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，其回歸方程為y=0.0298x+0.036，R2=0.9905，表明HA濃度在5 μg/mL～35 μg/mL的范圍內(nèi)，其濃度與吸光值線性關(guān)系良好。ACE的活力測(cè)定中HA含量的確定將根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算。

2.2 ACE的最適pH

pH對(duì)ACE活力的影響見圖2。從圖2可以看出，ACE在pH8.0的情況下活性最高，相對(duì)酶活定為100%。在不同的pH下，ACE的活力有著比較大的變化。pH在7.0～9.0范圍內(nèi)時(shí)，ACE相對(duì)活性均在80%以上，酶活損失率低。 當(dāng)ACE處于pH4.0時(shí)，ACE的相對(duì)酶活僅為3%，活性幾乎被完全抑制。

圖1 馬尿酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of HA

圖2 pH對(duì)ACE活性的影響Fig.2 Effect of pH on activity of ACE

2.3 ACE的最適反應(yīng)溫度

從圖3可知，在40 ℃下ACE活性最高，相對(duì)酶活定為100%。說明ACE反應(yīng)的最適溫度為40 ℃。在35～45 ℃范圍內(nèi)，ACE顯示出比較高的活性，損失率均在20%以下，低于30℃以及高于50 ℃的條件下都會(huì)對(duì)ACE活性有比較大的影響，酶活損失率都在50%以上。

2.4 氯離子對(duì)ACE活性的影響

從圖4可知，在加入Cl-后，與空白組相比，ACE的活性明顯升高。尤其是當(dāng)反應(yīng)體系中的濃度僅達(dá)到50 mmol/L時(shí)，相對(duì)酶活即從100%上升至380%。而后繼續(xù)升高濃度，酶活均有小幅提升，直至濃度達(dá)到350 mmol/L時(shí)，酶的活性最高，但此時(shí)隨著濃度的升高，酶活性反而下降。

圖3 溫度對(duì)ACE活性的影響Fig.3 Effect of pH on activity of ACE

圖4 氯離子對(duì)ACE活性的影響Fig.4 Effect of chloride ion on activity of ACE

2.5 金屬離子對(duì)ACE活力的影響

從圖5可知，在加入五種金屬離子的反應(yīng)體系之中，Co2+對(duì)于ACE活性的促進(jìn)作用最強(qiáng)，當(dāng)Co2+的濃度達(dá)到200 μmol/L時(shí)，ACE的相對(duì)酶活達(dá)到了235%，而后隨著濃度的增加，雖然其促進(jìn)作用有著一定程度的降低，但是ACE的相對(duì)活性一直保持在100%以上，也就是說相對(duì)空白對(duì)照組，Co2+對(duì)ACE活力有比較好的促進(jìn)作用。而Zn2+加入反應(yīng)體系后，濃度從100 μmol/L升至500 μmol/L，ACE的活力變化不大，說明Zn2+對(duì)ACE活力促進(jìn)并沒有太大作用，影響較小。Mg2+、Fe2+濃度在低濃度時(shí)，對(duì)ACE的活性影響較小，但隨著濃度的逐漸加大，這兩種金屬離子顯示出對(duì)ACE的一定的抑制作用。尤其是Fe2+，當(dāng)加入反應(yīng)體系中的濃度達(dá)到500 μmol/L時(shí)，ACE的相對(duì)活性僅為61%。而Mg2+的酶活也降到20%左右。

2.6 不同膠原蛋白的ACE抑制作用比較

從圖6可知，當(dāng)濃度在0.01 mg/mL～0.05 mg/mL時(shí)，三種不同的膠原蛋白均對(duì)ACE活性的抑制率較低，沒有表現(xiàn)出明顯的活性抑制作用。

圖5 金屬離子對(duì)ACE活性的影響Fig.5 Effect of metal ion on activity of ACE

圖6 不同膠原蛋白對(duì)ACE活性的影響Fig.6 Effect of different collagens on activity of ACE

當(dāng)加入的濃度到達(dá)0.1 mg/mL時(shí)，自制膠原蛋白對(duì)ACE活性的抑制率就達(dá)到了27%，而另外兩種商品化膠原蛋白的抑制率未超過20%。繼續(xù)升高濃度，自制膠原蛋白依然在ACE活性抑制作用上表現(xiàn)出很好的效果，在加入濃度為0.5 mg/mL時(shí)，就已達(dá)48%的抑制率，在同樣的濃度下，另外兩種商品化膠原蛋白的ACE抑制率與其相比差距明顯。而當(dāng)濃度升至1 mg/mL時(shí)，這種差距進(jìn)一步被拉大。

IC50是一種公認(rèn)檢驗(yàn)ACE抑制劑效果的指標(biāo)，IC50的值越小說明抑制ACE作用的效果越好。本研究中，自制膠原蛋白、德國(guó)產(chǎn)膠原蛋白、法國(guó)產(chǎn)膠原蛋白的ACE活性抑制回歸方程分別為：y=-29.702x2+88.499x+11.779，R2=0.9914、y=-34.766x2+85.556x+7.974，R2=0.9906以及y=-16.381x2+55.308x+11.774，R2=0.969。通過回歸方程計(jì)算得出其IC50分別為0.5241 mg/mL、0.6780 mg/mL和0.9696 mg/mL?？梢娮灾颇z原蛋白對(duì)ACE的抑制效果要優(yōu)于另外兩種商品化的膠原蛋白，其抑制效果接近法國(guó)產(chǎn)膠原蛋白的2倍。

3 討 論

本研究中，ACE反應(yīng)的最適pH為8.0，pH上升或降低，ACE的活性都會(huì)受到一定程度的影響。當(dāng)處于弱堿性環(huán)境中時(shí)，ACE表現(xiàn)出良好的活性，酶活變化不大。當(dāng)處于強(qiáng)酸性或強(qiáng)堿性環(huán)境中時(shí)，對(duì)酶活產(chǎn)生明顯的抑制作用，相對(duì)酶活均在50%以下。說明ACE是一種適合在弱堿性的環(huán)境中發(fā)揮作用的酶，這與體內(nèi)環(huán)境相似。ACE反應(yīng)的最適溫度為40 ℃，溫度的升高或降低，都會(huì)對(duì)ACE的活性有著一定的影響，說明ACE適合在比較溫和的溫度條件下發(fā)揮作用。

氯離子加入ACE反應(yīng)體系中后，能夠明顯提高ACE的活性。在適當(dāng)?shù)臐舛确秶鷥?nèi)，氯離子對(duì)ACE活性的促進(jìn)作用不斷增強(qiáng)。而隨著濃度繼續(xù)加大，對(duì)ACE活性的促進(jìn)作用有小幅度的下降。說明在反應(yīng)體系中加入適當(dāng)濃度的氯離子，能夠極大地促進(jìn)ACE的反應(yīng)效率。

通常情況下，以金屬離子作為輔基的酶，金屬離子對(duì)酶活非常重要，這種酶都具有特定的金屬離子輔基，反應(yīng)體系中的金屬離子對(duì)酶活的影響與其濃度關(guān)系密切。本研究中，在低濃度下，Co2+對(duì)ACE活性有著明顯的促進(jìn)作用，當(dāng)反應(yīng)體系中Co2+濃度在300 mM時(shí)，ACE的活性最高，但隨著濃度的繼續(xù)升高(>400 mM)，酶活略有下降，但總體都顯示出其對(duì)ACE活性促進(jìn)的作用。Zn2+對(duì)于ACE活性的作用不明顯，隨著濃度的升高，ACE活性并沒有太大的變化，與空白組相比，酶活力變化很小。而Mg2+、Fe2+均有不同程度地對(duì)抑制ACE的活性，隨著濃度的增大，抑制作用也越加明顯。尤其是Fe2+，具有很強(qiáng)的ACE活性抑制效果。因此，添加適宜的金屬離子，對(duì)于ACE活性具有有效的促進(jìn)或抑制作用。

膠原蛋白，被廣泛證明能夠抑制ACE的活性。本研究中，自制的膠原蛋白肽對(duì)ACE抑制活性要高于國(guó)外進(jìn)口膠原蛋白肽商品，并且通過與近年來發(fā)表的參考文獻(xiàn)[15-16]中的IC50相比較，自制膠原蛋白肽顯示出較好的ACE抑制活性，這與該膠原蛋白肽的生產(chǎn)工藝關(guān)系密切。市售商品化膠原蛋白肽多數(shù)為加入強(qiáng)酸、強(qiáng)堿或酶生產(chǎn)的膠原肽，其實(shí)質(zhì)上已經(jīng)使大部分膠原蛋白變性，破壞了膠原蛋白原有的三維結(jié)構(gòu)，從而失去了原有生物活性。而本研究制備的膠原蛋白肽是在酸堿溫和、低溫(18 ℃)的條件下制備的產(chǎn)品，最大限度地保留了膠原蛋白原有的三維空間構(gòu)象，使之表現(xiàn)出了較高的生物活性。總之，膠原蛋白肽可能對(duì)高血壓病具有很好的降血壓效果，這將對(duì)人和動(dòng)物的高血壓疾病治療提供了新的途徑。膠原蛋白肽的降血壓作用的動(dòng)物和人體試驗(yàn)，將會(huì)在后續(xù)試驗(yàn)中得到確切驗(yàn)證。

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StudyonPropertiesofAngiotensinConvertingEnzymeandEffectofItsActivityInhibitedbyCollagenPeptides

LI Xiao-chen1,2,LIU Shuang2，DENG Xiao-xia2，WANG Zi-hua2,SUN Xiao-yue2,JIANG Hong-de1,2，WU De-feng1*，PANG Hai3*

(1.CollegeofAnimalScience,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou,Fujian350002,China；2.JinziyuanBiotechCo.LTD.,Shuangliao,Jilin136400,China;3.SchoolofMedicine,TsinghuaUniversity,Beijing100084,China)

Angiotensin Converting Enzyme (ACE),associated with human and animal blood pressure,is a drug target for treatment of hypertension disease.Screening of ACE inhibitors is important to the discovery of drug compounds which will help develop a new drug in preventing hypertension.In the study,ACE from pig lung tissues was purified.First,the ACE properties were investigated,and three different collagen peptides to inhibit the ACE activity were experimentally compared.Using spectrophotometry and ACE reaction substrate HHL (Hip-His-Leu),activity of the ACE was examined.The results showed that optimal pH of the ACE is 8.0 and its optimal temperature is 40 ℃.The ACE activity was significantly enhanced in 350 mmol/L Cl- solution.But,some metal ions showed inhibit or enhance the activity of ACE.In comparison,the collagen peptide in the experiment showed higher inhibitory activity to the ACE than other two commercial collagen peptides.

agiotensin converting enzyme; enzymatic properties; collagen peptides; inhibitory activity

2014-03-26，

2014-04-18

李梟辰(1988-)，男，福建南平人，碩士研究生，主要從事中西獸藥藥理學(xué)及新制劑研究。E-mail: 742936379@qq.com

*[通訊作者]吳德峰(1951-)，男，浙江金華人，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中獸醫(yī)學(xué)、藥理學(xué)及生態(tài)學(xué)等領(lǐng)域研究。 E-mail: zj99289@yeah.net 龐 海(1961-)，男，吉林通化人，副教授，博士生導(dǎo)師，主要從事蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究。 E-mail: panghai@mail.tsinghua.edu.cn

S811.6

A

1005-5228(2014)07-0049-05