張紅強,李丹妮,陳 建
(重慶第三軍醫(yī)大學附屬新橋醫(yī)院 腎內(nèi)科 血液凈化中心,重慶,400037)
鐵缺乏在慢性腎臟病患者,特別是接受維持性血液透析(MHD)的患者中很常見,是導致腎性貧血的重要原因之一。而腎性貧血是促進慢性腎衰竭進展、增加心腦血管并發(fā)癥的發(fā)生率及病死率的重要危險因素[1]。靜脈鐵劑和口服鐵劑都能改善這種鐵缺乏狀態(tài),且前者療效更顯著,副作用小,臨床用藥相對方便,所以靜脈鐵劑的臨床應用更為廣泛[2-3]。但是二者都會加重MHD患者體內(nèi)的氧化應激狀態(tài),進而加劇微炎癥狀態(tài)[4]、感染、心血管并發(fā)癥[5]等的發(fā)生。已有臨床報道[6]稱口服或靜脈補充維C[7]都可以減輕補鐵劑誘導的MHD患者氧化應激狀態(tài)。
HPBMC即外周血中具有單個核的細胞,包括淋巴細胞和單核細胞,發(fā)揮細胞免疫功能。HPBMC易被細胞因子和線粒體氧化損傷激活,進而ROS生成量增多并發(fā)生凋亡,這是造成MHD患者外周血免疫細胞數(shù)量減少,免疫功能缺陷的重要原因之一[8]。在進行MHD治療時常用靜脈鐵劑來糾正患者鐵缺乏,增加鐵儲備,研究發(fā)現(xiàn)這同時也發(fā)現(xiàn)其會加重MHD患者體內(nèi)的氧化應激狀態(tài)[9]。這是否跟靜脈鐵劑對MHD患者外周血單核細胞(HPBMC)氧化應激加劇和細胞凋亡的影響有關(guān)尚不清楚,因此本研究使用靜脈鐵劑處理體外培養(yǎng)的MHD患者HPBMC,并使用維C進行干預,探索靜脈鐵劑對HPBMC的氧化應激和細胞凋亡的影響以及維C對此的干預作用。
流式細胞儀(BD FACS ARIA,美國),Western blot成像儀(Carestream Health,美國),多功能酶標儀(Beckman Coulter,美國),4種靜脈鐵劑(西南藥業(yè),重慶),維生素C注射液(雙鶴藥業(yè),北京),單個核細胞分離液(灝洋生物科技,天津),RPMI 1 640培養(yǎng)基(Hyclone,美國),胎牛血清(Hyclone,美國),Bax、Bcl-2一抗(Santa Cruz,美國),HRP標記山羊抗兔二抗、Caspase-3的活性檢測試劑盒(碧云天,江蘇海門),ROS Fluorescent Probe-DHE(Sigma,美國),Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒(三箭生物科技,天津)。
取10 mL肝素鈉抗凝外周靜脈血按血:分離液按1∶2的比例緩慢注入人淋巴細胞分離液上層,400 g 20 ℃離心30 min,取白膜層細胞重懸于4倍體積的RPMI 1 640中,200 g,10 min離心洗細胞,重復2次。按1×106個/mL的濃度將細胞接種于含10%胎牛血清、1%雙抗的RPMI 1 640培養(yǎng)基中,加入植物血凝素(PHA)至終濃度300 μg/mL。
按照上述方法培養(yǎng)24 h,然后更換為不含PHA的1 640培養(yǎng)液,分為對照組,Is處理組,Id處理組,F(xiàn)g處理組,F(xiàn)c處理組,Id+維C干預組。4種靜脈鐵劑的濃度均為200 μg/mL,維C的終濃度為25 μmol/L。對照組給予1640培養(yǎng)基,Is、Id、Fg、Fc處理組分別給予含對應靜脈鐵劑的1 640培養(yǎng)基,培養(yǎng)8 h; Id+維C干預組先給予含Id的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)2 h,再加入維C繼續(xù)培養(yǎng)至6 h。收集細胞進行后續(xù)實驗。
使用Annexin V/PI雙染法檢測細胞凋亡率:收集細胞用孵育緩沖液洗滌1次,800 r/min離心5 min。用100 μL孵育緩沖液重懸細胞,加入5 μL FITC標記的抗Annexin V抗體,室溫下避光孵育10 min后加入5 μL PI染色5 min,染色結(jié)束后加入500 μL PBS以終止反應并上機檢測。
收集的細胞用RIPA 細胞裂解液裂解,超聲破碎后用12 000 g離心10 min,收集上清采用BCA法測定蛋白濃度,取蛋白樣品與5X蛋白上樣緩沖液混勻,95 ℃金屬浴5 min。配制并灌注12%的分離膠和5%濃縮膠,每孔上樣蛋白30 μg左右。80 V (30 min),120 V (90 min)的電泳結(jié)束后采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜,300 mA (60 min)。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后,用5%脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉1 h以上,加入一抗4 ℃孵育過夜。次日用TBST洗滌10 min 2次,加入HRP標記二抗室溫孵育2 h。再次TBXT 洗滌10 min 2次,ECL發(fā)光顯影。分別檢測Bax和Bcl-2,以及蛋白質(zhì)上樣內(nèi)參GAPDH的表達。結(jié)果用Quantity One凝膠圖像分析系統(tǒng)進行條帶的灰度分析。
按照碧云天的Caspase-3的活性檢測試劑盒(C1115)說明書進行實驗。
收集細胞,重懸細胞于孵育緩沖液中,加入ROS Fluorescent Probe-DHE至終濃度為2 μM,并置于37 ℃避光孵育15 min。孵育緩沖液洗滌細胞1次,800 r/min離心5 min,加入400 μL PBS重懸細胞并上機檢測。
① 不同靜脈鐵劑對HPBMC細胞凋亡的影響: 4種靜脈鐵劑處理組的細胞凋亡率分別是Is (42.38±2.74)%,Id (40.51±2.13)%,F(xiàn)g (41.79±2.82)%,F(xiàn)c (40.47±1.97)%,均明顯高于對照組(20.13±1.16)%(P<0.01),且4組之間無顯著差異(P>0.05)。見表1; ② 維C干預對Id誘導的HPBMC細胞凋亡的作用: Id+維C干預組的細胞凋率為(29.09±1.29)%,明顯低于Id處理組(40.51±2.13)%(P<0.05)。見表1。
① Id對HPBMC促凋亡基因Bax,以及抗凋亡基因Bcl-2蛋白表達的影響(圖1): 采用Quantity One凝膠圖像分析系統(tǒng)分析雜交條帶的灰度值,結(jié)果顯示:Id處理組的Bax,Bcl-2蛋白表達量分別是對照組的(2.09±0.21),(0.46±0.11)倍,(P<0.05); ② 維C干預對Id誘導Bax和Bcl-2蛋白表達的作用(圖1): Id+維C干預組的Bax,Bcl-2蛋白表達量分別是對照組的(1.13±0.25),(0.87±0.16)倍,維C干預降低了凋亡基因Bax的表達,增加了抗凋亡基因Bcl-2的表達,(P<0.05)。
表1 不同靜脈鐵劑對HPBMC細胞凋亡率的影響及維C的干預作用 %
與CTRL比較,*P<0.05;與Id比較,#P<0.05。
① Id對HPBMC凋亡分子Caspase-3活性的影響(圖2): 測得各組405 nm吸光度值后,與對照組相比,結(jié)果顯示:Id處理組的Caspase-3活性是對照組的(3.51±0.33)倍(P<0.05); ②維C干預對Id誘導的Caspase-3活化的作用(圖2): Id+維C干預組的Caspase-3活性是對照組的(1.87±0.26)倍,維C干預降低了凋亡分子Caspase-3的活性(P<0.05)。
① Id對HPBMC細胞ROS陽性率的影響(圖3): Id處理組的細胞ROS陽性率為(68.32±4.57)%,明顯高于對照組(42.87±4.05)%(P<0.05); ② 維C干預對Id誘導的細胞ROS生成量增加的作用(圖3): Id+維C干預組的細胞ROS陽性率為(53.79±4.11)%,明顯低于Id處理組(68.32±4.57)%(P<0.05)。
圖2 Id對HPBMC凋亡分子Caspase-3的影響及維C的干預作用
鐵是十分重要的微量元素,參與構(gòu)成多種活性酶,也是血紅蛋白中O2的載體。但是MHD患者由于攝入不足、透析過程中丟失、胃腸道慢性失血等原因,常出現(xiàn)缺鐵性貧血[10],因而臨床上常采用靜脈鐵劑給其補鐵。但是靜脈補鐵后,體內(nèi)游離鐵增加,通過Fenton /Haber-Weiss反應催化產(chǎn)生代表ROS的羥基和烷氧基,觸發(fā)脂質(zhì)過氧化,引起氧化應激反應加劇,促進微炎癥狀態(tài),感染等并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展[11-12]。臨床研究[13]發(fā)現(xiàn),口服或靜脈補充維C,以及使用維C透析液都可以減輕補鐵劑誘導的MHD患者氧化應激狀態(tài)。目前,靜脈鐵劑誘導MHD患者氧化應激以及使用抗氧化劑維C對此進行干預都體現(xiàn)在患者體內(nèi)氧化應激一系列指標的改變上,尚沒有做深入研究。本研究采用體外培養(yǎng)的MHD患者HPBMC,探索靜脈鐵劑對其凋亡的影響以及維C對此過程的干預作用,欲探索靜脈鐵劑誘導MHD患者氧化應激,促進微炎癥狀態(tài),感染等并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展的內(nèi)在機制是否與HPMBC的凋亡有關(guān)。
A為對照組; B為Id處理組; C為Id+維C干預組
HPMBC主要包括T、B淋巴細胞及少量單核細胞,其增殖與凋亡之間的動態(tài)平衡是維持人體正常防御與監(jiān)視功能的保證。研究[14]發(fā)現(xiàn),HPBMC的凋亡與MHD患者細胞免疫功能缺陷密切聯(lián)系。細胞凋亡是細胞死亡的形式之一,凋亡早期,位于細胞膜內(nèi)側(cè)的磷酯酰絲氨酸(PS)可遷移至細胞外側(cè), Annexin V可與PS發(fā)生特異性結(jié)合,是目前流式細胞定量檢測細胞凋亡的首選方法。本研究采用此法發(fā)現(xiàn)4種靜脈鐵劑處理的MHD患者HPMBC后,其凋亡率顯著高于對照組(表1),證實靜脈鐵劑可誘導MHD患者HPMBC的凋亡,與文獻[15]報道相一致。進一步采用Western blotting分析法和Casepase-3活性檢測試劑盒檢測發(fā)現(xiàn)靜脈鐵劑Id處理的HPBMC細胞促凋亡因子Bax表達增加,抗凋亡蛋白Bcl-2表達減少(圖1),凋亡分子Casepase-3被激活(圖2),說明靜脈鐵劑處理會激活HPBMC細胞內(nèi)的凋亡信號。這些結(jié)果都證實,靜脈鐵劑能夠誘導MHD 患者HPBMC的細胞凋亡。
作為免疫細胞,HPBMC易被細胞因子和線粒體氧化損傷所激活,ROS生成量增多,凋亡信號激活,進而發(fā)生凋亡,這提示靜脈鐵劑對HPBMC凋亡的誘導可能與其促進細胞氧化應激和線粒體氧化損傷有關(guān)。故本研究探索了靜脈鐵劑對HPBMC細胞ROS生成量的影響,F(xiàn)CM檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)Id處理的HPBMC細胞ROS陽性率明顯高于對照組(圖3),證實了靜脈鐵劑能加劇HPBMC的氧化損傷程度。鑒于維C在臨床上用于改善靜脈鐵劑誘導MHD患者氧化應激狀態(tài),本研究進一步探索了維C對靜脈鐵劑誘導的HPBMC的氧化應激和細胞凋亡的干預作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)維C干預能使Id處理的HPBMC細胞促凋亡因子Bax表達下調(diào),抗凋亡蛋白Bcl-2表達增加(圖1),凋亡分子Casepase-3活性下降(圖2),ROS生成量減少(圖3),最終抑制了靜脈鐵劑Id誘導的HPBMC細胞凋亡。因此(表1),本研究在體外驗證了抗氧化劑維C能減輕靜脈鐵劑Id誘導的MHD患者HPBMC的ROS生成和細胞凋亡。
綜上所述,本研究證實靜脈鐵劑能加劇體外培養(yǎng)的MHD患者HPBMC細胞的氧化應激狀態(tài),并誘導細胞凋亡,維生素C對此的干預作用也與臨床報道相符。這可能是靜脈鐵劑誘導MHD患者氧化應激,促進微炎癥狀態(tài),感染等并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展的內(nèi)在機制之一。
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