湖南省常德地區(qū)雞致病性大腸桿菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

李娜　張保平　王文彬等

摘要：從湖南省常德地區(qū)的3個(gè)不同雞場(chǎng)采集105份病料，通過細(xì)菌分離和生化鑒定共分離得到75株雞源性大腸桿菌，其中60株為致病性大腸桿菌。對(duì)分離得到的75株雞大腸桿菌進(jìn)行30種抗生素的敏感性試驗(yàn)表明，分離菌株對(duì)30種抗菌藥物均有不同程度的耐藥性，且多重耐藥現(xiàn)象普遍；在30種受試藥物中，高敏的藥物分別為頭孢曲松、頭孢哌酮、頭孢他啶、頭孢唑啉、頭孢噻肟、丁胺卡那霉素等6種。

關(guān)鍵詞：雞；致病性大腸桿菌；耐藥性

中圖分類號(hào)： S852.61+2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）07-0226-03

收稿日期：2013-10-10

基金項(xiàng)目：湖南省“十二五”重點(diǎn)建設(shè)學(xué)科（動(dòng)物學(xué)）項(xiàng)目（編號(hào)：湘教發(fā)[2011]76 號(hào)）；湖南省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（編號(hào)：2008244）；湖南省動(dòng)物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（編號(hào)：200824632）；湖南文理學(xué)院青年專項(xiàng)基金（編號(hào)：QNYX0811）。

作者簡(jiǎn)介：李娜（1977—），女，吉林長(zhǎng)春人，碩士，講師，研究方向?yàn)轭A(yù)防獸醫(yī)學(xué)。E-mail：vetlina@163.com。大腸桿菌為臨床上常見的病原菌，在腹瀉畜禽的糞便中及各種原因引起的敗血癥畜禽中都能分離到致病性大腸桿菌。該病的主要特征包括心包炎、肝周炎、臍炎、氣囊炎、敗血癥、眼炎、滑膜炎、卵黃性腹膜炎等，多繼發(fā)新城疫、傳染性喉氣管炎等疾病，導(dǎo)致雞群高死亡率，對(duì)養(yǎng)雞生產(chǎn)的危害極大[1]。國(guó)內(nèi)已有很多關(guān)于雞大腸桿菌病流行病學(xué)的研究報(bào)道，主要針對(duì)我國(guó)的主要?。ㄊ校鴮?duì)較小的市、縣的研究報(bào)道并不多。由于大腸桿菌血清型多、抗原復(fù)雜，在小區(qū)域間也存在較大差異；同時(shí)隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，大腸桿菌的耐藥性越來越強(qiáng)。為了能準(zhǔn)確防治雞大腸桿菌病，應(yīng)在盡可能小的區(qū)域內(nèi)對(duì)其進(jìn)行病原血清型調(diào)查，并合理用藥。目前，國(guó)內(nèi)尚無(wú)對(duì)湖南省常德地區(qū)雞場(chǎng)大腸桿菌耐藥性監(jiān)測(cè)的調(diào)查研究報(bào)道。為此，筆者從2006年10月至2012年12月對(duì)湖南省常德地區(qū)范圍內(nèi)的雞大腸桿菌病流行情況和耐藥情況進(jìn)行了調(diào)查和監(jiān)測(cè)，以了解湖南省常德地區(qū)的主要流行菌株的耐藥規(guī)律，為獸醫(yī)臨床用藥提供指導(dǎo)性參考意見。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1病料采集在2006年10月至2012年12月期間，選取105份湖南省常德地區(qū)飼養(yǎng)的疑似大腸桿菌病雞的臟器。

1.1.2培養(yǎng)基及試劑普通瓊脂平板培養(yǎng)基、三糖鐵（TSI）瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美蘭（EMB）瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱（MAC）瓊脂培養(yǎng)基，購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司；生化試驗(yàn)微量發(fā)酵管，購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；普通營(yíng)養(yǎng)肉湯，自制。

1.1.3試驗(yàn)動(dòng)物18～25 g/只的小白鼠，購(gòu)自湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)小動(dòng)物室。

1.1.4藥敏紙片試驗(yàn)用藥敏紙片共30種，包括阿莫西林、哌拉西林、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、氨芐青霉素、苯唑青霉素、妥布霉素、慶大霉素、丁胺卡那霉素、鏈霉素、頭孢哌酮、頭孢他啶、頭孢唑啉、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢氨芐、四環(huán)素、氯霉素、紅霉素、新霉素、壯觀霉素、強(qiáng)力霉素、林可霉素、乙酰螺旋霉素、氯潔霉素、呋喃妥因、氨曲南、復(fù)方新諾明、利福平等，購(gòu)于杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)菌形態(tài)與分離培養(yǎng)將采集的新鮮病料分別劃線接種于普通培養(yǎng)基、MAC、EMB培養(yǎng)基上，同時(shí)分別穿刺TSI瓊脂管，置于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)18～24 h后觀察；挑取疑似的單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，將培養(yǎng)特性及形態(tài)、染色反應(yīng)、排列均符合大腸桿菌特征的菌株劃線接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上進(jìn)行細(xì)菌的數(shù)次純化，然后將純化的細(xì)菌接種于普通斜面培養(yǎng)基上，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2生化特性鑒定將分離的60個(gè)致病菌株接種于普通肉湯中，37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24～48 h后適量接種于葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、棉子糖、尿素、H2S、靛基質(zhì)、鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、MR、VP微量發(fā)酵管中，置于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h后觀察生化反應(yīng)結(jié)果。靛基質(zhì)發(fā)酵管中滴加1滴靛基質(zhì)試劑、MR發(fā)酵管中滴加1滴MR試劑即可觀察結(jié)果；VP發(fā)酵管中滴加2滴VP甲液、1滴VP乙液，置于37 ℃培養(yǎng)2 h即可觀察結(jié)果。

1.2.3大腸桿菌致病性試驗(yàn)取已鑒定的、生化反應(yīng)符合大腸桿菌的各個(gè)菌株于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)18 h的普通肉湯培養(yǎng)物（菌液濃度為3.0×109 CFU/mL），經(jīng)純粹檢驗(yàn)合格后分別腹腔接種18～25 g小白鼠，按0.2 mL/只的劑量接種，每個(gè)菌株接種6只；對(duì)照組按相同的途徑接種0.2 mL普通肉湯培養(yǎng)液，共接種6只。接種后飼養(yǎng)觀察120 h小白鼠的存活情況，記錄小白鼠的死亡時(shí)間并對(duì)死亡小白鼠進(jìn)行剖檢取肝臟、心臟，用EMB平板進(jìn)行接種菌回收試驗(yàn)以分離致病菌。

1.2.4分離菌藥物敏感性試驗(yàn)采用WHO推薦的 Kriby-Bauer （K-B）法[2]對(duì)分離鑒定的75株大腸桿菌進(jìn)行耐藥性監(jiān)測(cè)，判斷標(biāo)準(zhǔn)參照美國(guó)國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（NCCLS）頒布的M100-S15藥敏試驗(yàn)紙片擴(kuò)散法法規(guī)[2]和相關(guān)文獻(xiàn)[3-4]，以高敏、中敏、低敏或耐藥3種形式對(duì)抑菌圈大小作出判定。先將菌株接種到普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上，37 ℃ 恒溫箱培養(yǎng)18 h，用生理鹽水洗下菌苔；將菌懸液稀釋到麥?zhǔn)媳葷峁苤?，相?dāng)于終濃度5×107～1×108 CFU/mL；將普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂傾注于直徑為10 cm的平皿上，制成厚4 mm的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，15 min內(nèi)用滅菌棉拭子蘸取上述濃度的菌懸液，在管內(nèi)壁擠去多余菌液后在瓊脂平板表面涂布接種3次，每次旋轉(zhuǎn)70°，最后沿平板內(nèi)緣涂抹1周；室溫干燥3～5 min后，用無(wú)菌鑷子將藥敏紙片緊貼于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板表面，各紙片中心的距離應(yīng)大于24 mm，紙片距平板內(nèi)緣的距離應(yīng)大于 15 mm；37 ℃恒溫箱培養(yǎng)16～18 h后觀察結(jié)果，記錄各紙片的抑菌圈直徑。endprint

2結(jié)果與分析

2.1細(xì)菌形態(tài)及生長(zhǎng)情況

由細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果可知，在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上的菌落生長(zhǎng)良好、濕潤(rùn)，呈現(xiàn)半透明狀態(tài)與灰白色，邊緣光滑；在EMB瓊脂培養(yǎng)基平板上的細(xì)菌形成中等大小、邊緣整齊、表面光滑、黑紫色帶金屬光澤的菌落；在MAC瓊脂培養(yǎng)基平板上的細(xì)菌長(zhǎng)出圓形粉紅色、表面光滑圓形中等大小的菌落；TSI管底及斜面培養(yǎng)的細(xì)菌均變黃色，產(chǎn)氣而不產(chǎn)硫化氫；經(jīng)過革蘭氏染色鏡檢后，鏡下均可見大量散在的紅色、中等大小、兩端鈍圓的無(wú)芽孢G-短小直桿菌。

2.2分離菌的生化特性

分別對(duì)分離出的60株致病細(xì)菌進(jìn)行生化試驗(yàn)，結(jié)果均符合大腸桿菌的生化特性，詳見表1。

2.3大腸桿菌致病性試驗(yàn)

小白鼠在接種分離菌12 h后，均表現(xiàn)出精神不振，18 h后開始出現(xiàn)死亡，48 h后全部死亡；而對(duì)照組小白鼠健康活潑。剖檢死亡的小白鼠可見肝臟腫大瘀血，表面散在針尖大小的出血點(diǎn)，心包膜、腹膜、肺、腎、脾臟均有不同程度的出血。從死亡小白鼠的肝臟、心臟中均可分離到分離菌。綜合試驗(yàn)結(jié)果可知，分離菌株的培養(yǎng)特性、形態(tài)、染色反應(yīng)均符合大腸桿菌特性，確定為致病性大腸桿菌。

2.4分離菌藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

以抑菌圈直徑大小作為判定藥物敏感性高低的標(biāo)準(zhǔn)，抑菌圈直徑越大表明細(xì)菌對(duì)該藥的敏感性越高。抑菌圈直徑≥21 mm為高度敏感；在15.1～20.0 mm范圍內(nèi)為中度敏感；≤14 mm 為低敏或耐藥。抑菌圈直徑的測(cè)定結(jié)果見表2。研究表明，雖然常德地區(qū)3個(gè)不同養(yǎng)雞場(chǎng)的大腸桿菌菌株對(duì)30種藥物的敏感性存在一定差異，但是同一養(yǎng)雞場(chǎng)的大腸桿菌菌株對(duì)抗生素的敏感性幾乎一致。

養(yǎng)殖戶把藥物防治作為控制大腸桿菌的主要手段，但藥敏試驗(yàn)普及率很低，用藥盲目性非常大，且在實(shí)際生產(chǎn)中有時(shí)用藥不合理，如低劑量長(zhǎng)時(shí)間使用，隨意加大劑量或根據(jù)個(gè)人經(jīng)驗(yàn)感覺盲目添加等，均會(huì)造成大腸桿菌嚴(yán)重耐藥，從而導(dǎo)致藥效下降甚至無(wú)效，藥物控制難度增大，耐藥菌株增多。75 株受試大腸桿菌均對(duì)除頭孢曲松外的29種抗菌藥物有多重耐藥性，表現(xiàn)為對(duì)4種或4種以上藥物耐藥，8耐菌株所占比例最大，為14.67%；其次是5耐、9耐，分別占10.67%、9.33%。因此在臨床用藥方面或作為飼料添加藥物時(shí)，有條件的應(yīng)該進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，盡量選擇高效敏感的藥物，盡量避免長(zhǎng)期大量使用同一種藥物，也可以幾種藥物交替使用，要足量、按療程給藥，以免產(chǎn)生耐藥性。

參考文獻(xiàn)：

[1]劉觀忠，趙超，董修建.“痢得?！睂?duì)蛋用雛雞大腸桿菌病的治療效果及作用機(jī)理研究[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，2012（11）：145-147.

[2]Wayne P A. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing[M]. Pennsylvania：NCCLS，2001：1-23.

[3]李剛，文英，鐵生虎，等. 規(guī)模化豬場(chǎng)仔豬致病性大腸埃希菌的耐藥性檢測(cè)[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，31（8）：117-121.

[4]Khan A，Das S C，Ramamurthy T，et al. Antibiotic resistance，virulence gene，and molecular profiles of Shiga toxin-producing Escherichia coli isolates from diverse sources in Calcutta，India[J]. Journal of Clinical Microbiology，2002，40（6）：2009-2015.endprint

2結(jié)果與分析

2.1細(xì)菌形態(tài)及生長(zhǎng)情況

由細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果可知，在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上的菌落生長(zhǎng)良好、濕潤(rùn)，呈現(xiàn)半透明狀態(tài)與灰白色，邊緣光滑；在EMB瓊脂培養(yǎng)基平板上的細(xì)菌形成中等大小、邊緣整齊、表面光滑、黑紫色帶金屬光澤的菌落；在MAC瓊脂培養(yǎng)基平板上的細(xì)菌長(zhǎng)出圓形粉紅色、表面光滑圓形中等大小的菌落；TSI管底及斜面培養(yǎng)的細(xì)菌均變黃色，產(chǎn)氣而不產(chǎn)硫化氫；經(jīng)過革蘭氏染色鏡檢后，鏡下均可見大量散在的紅色、中等大小、兩端鈍圓的無(wú)芽孢G-短小直桿菌。

2.2分離菌的生化特性

分別對(duì)分離出的60株致病細(xì)菌進(jìn)行生化試驗(yàn)，結(jié)果均符合大腸桿菌的生化特性，詳見表1。

2.3大腸桿菌致病性試驗(yàn)

小白鼠在接種分離菌12 h后，均表現(xiàn)出精神不振，18 h后開始出現(xiàn)死亡，48 h后全部死亡；而對(duì)照組小白鼠健康活潑。剖檢死亡的小白鼠可見肝臟腫大瘀血，表面散在針尖大小的出血點(diǎn)，心包膜、腹膜、肺、腎、脾臟均有不同程度的出血。從死亡小白鼠的肝臟、心臟中均可分離到分離菌。綜合試驗(yàn)結(jié)果可知，分離菌株的培養(yǎng)特性、形態(tài)、染色反應(yīng)均符合大腸桿菌特性，確定為致病性大腸桿菌。

2.4分離菌藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

以抑菌圈直徑大小作為判定藥物敏感性高低的標(biāo)準(zhǔn)，抑菌圈直徑越大表明細(xì)菌對(duì)該藥的敏感性越高。抑菌圈直徑≥21 mm為高度敏感；在15.1～20.0 mm范圍內(nèi)為中度敏感；≤14 mm 為低敏或耐藥。抑菌圈直徑的測(cè)定結(jié)果見表2。研究表明，雖然常德地區(qū)3個(gè)不同養(yǎng)雞場(chǎng)的大腸桿菌菌株對(duì)30種藥物的敏感性存在一定差異，但是同一養(yǎng)雞場(chǎng)的大腸桿菌菌株對(duì)抗生素的敏感性幾乎一致。

養(yǎng)殖戶把藥物防治作為控制大腸桿菌的主要手段，但藥敏試驗(yàn)普及率很低，用藥盲目性非常大，且在實(shí)際生產(chǎn)中有時(shí)用藥不合理，如低劑量長(zhǎng)時(shí)間使用，隨意加大劑量或根據(jù)個(gè)人經(jīng)驗(yàn)感覺盲目添加等，均會(huì)造成大腸桿菌嚴(yán)重耐藥，從而導(dǎo)致藥效下降甚至無(wú)效，藥物控制難度增大，耐藥菌株增多。75 株受試大腸桿菌均對(duì)除頭孢曲松外的29種抗菌藥物有多重耐藥性，表現(xiàn)為對(duì)4種或4種以上藥物耐藥，8耐菌株所占比例最大，為14.67%；其次是5耐、9耐，分別占10.67%、9.33%。因此在臨床用藥方面或作為飼料添加藥物時(shí)，有條件的應(yīng)該進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，盡量選擇高效敏感的藥物，盡量避免長(zhǎng)期大量使用同一種藥物，也可以幾種藥物交替使用，要足量、按療程給藥，以免產(chǎn)生耐藥性。

參考文獻(xiàn)：

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[2]Wayne P A. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing[M]. Pennsylvania：NCCLS，2001：1-23.

[3]李剛，文英，鐵生虎，等. 規(guī)?；i場(chǎng)仔豬致病性大腸埃希菌的耐藥性檢測(cè)[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，31（8）：117-121.

[4]Khan A，Das S C，Ramamurthy T，et al. Antibiotic resistance，virulence gene，and molecular profiles of Shiga toxin-producing Escherichia coli isolates from diverse sources in Calcutta，India[J]. Journal of Clinical Microbiology，2002，40（6）：2009-2015.endprint

2結(jié)果與分析

2.1細(xì)菌形態(tài)及生長(zhǎng)情況

由細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果可知，在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上的菌落生長(zhǎng)良好、濕潤(rùn)，呈現(xiàn)半透明狀態(tài)與灰白色，邊緣光滑；在EMB瓊脂培養(yǎng)基平板上的細(xì)菌形成中等大小、邊緣整齊、表面光滑、黑紫色帶金屬光澤的菌落；在MAC瓊脂培養(yǎng)基平板上的細(xì)菌長(zhǎng)出圓形粉紅色、表面光滑圓形中等大小的菌落；TSI管底及斜面培養(yǎng)的細(xì)菌均變黃色，產(chǎn)氣而不產(chǎn)硫化氫；經(jīng)過革蘭氏染色鏡檢后，鏡下均可見大量散在的紅色、中等大小、兩端鈍圓的無(wú)芽孢G-短小直桿菌。

2.2分離菌的生化特性

分別對(duì)分離出的60株致病細(xì)菌進(jìn)行生化試驗(yàn)，結(jié)果均符合大腸桿菌的生化特性，詳見表1。

2.3大腸桿菌致病性試驗(yàn)

小白鼠在接種分離菌12 h后，均表現(xiàn)出精神不振，18 h后開始出現(xiàn)死亡，48 h后全部死亡；而對(duì)照組小白鼠健康活潑。剖檢死亡的小白鼠可見肝臟腫大瘀血，表面散在針尖大小的出血點(diǎn)，心包膜、腹膜、肺、腎、脾臟均有不同程度的出血。從死亡小白鼠的肝臟、心臟中均可分離到分離菌。綜合試驗(yàn)結(jié)果可知，分離菌株的培養(yǎng)特性、形態(tài)、染色反應(yīng)均符合大腸桿菌特性，確定為致病性大腸桿菌。

2.4分離菌藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

以抑菌圈直徑大小作為判定藥物敏感性高低的標(biāo)準(zhǔn)，抑菌圈直徑越大表明細(xì)菌對(duì)該藥的敏感性越高。抑菌圈直徑≥21 mm為高度敏感；在15.1～20.0 mm范圍內(nèi)為中度敏感；≤14 mm 為低敏或耐藥。抑菌圈直徑的測(cè)定結(jié)果見表2。研究表明，雖然常德地區(qū)3個(gè)不同養(yǎng)雞場(chǎng)的大腸桿菌菌株對(duì)30種藥物的敏感性存在一定差異，但是同一養(yǎng)雞場(chǎng)的大腸桿菌菌株對(duì)抗生素的敏感性幾乎一致。

養(yǎng)殖戶把藥物防治作為控制大腸桿菌的主要手段，但藥敏試驗(yàn)普及率很低，用藥盲目性非常大，且在實(shí)際生產(chǎn)中有時(shí)用藥不合理，如低劑量長(zhǎng)時(shí)間使用，隨意加大劑量或根據(jù)個(gè)人經(jīng)驗(yàn)感覺盲目添加等，均會(huì)造成大腸桿菌嚴(yán)重耐藥，從而導(dǎo)致藥效下降甚至無(wú)效，藥物控制難度增大，耐藥菌株增多。75 株受試大腸桿菌均對(duì)除頭孢曲松外的29種抗菌藥物有多重耐藥性，表現(xiàn)為對(duì)4種或4種以上藥物耐藥，8耐菌株所占比例最大，為14.67%；其次是5耐、9耐，分別占10.67%、9.33%。因此在臨床用藥方面或作為飼料添加藥物時(shí)，有條件的應(yīng)該進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，盡量選擇高效敏感的藥物，盡量避免長(zhǎng)期大量使用同一種藥物，也可以幾種藥物交替使用，要足量、按療程給藥，以免產(chǎn)生耐藥性。

參考文獻(xiàn)：

[1]劉觀忠，趙超，董修建.“痢得?！睂?duì)蛋用雛雞大腸桿菌病的治療效果及作用機(jī)理研究[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，2012（11）：145-147.

[2]Wayne P A. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing[M]. Pennsylvania：NCCLS，2001：1-23.

[3]李剛，文英，鐵生虎，等. 規(guī)?；i場(chǎng)仔豬致病性大腸埃希菌的耐藥性檢測(cè)[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，31（8）：117-121.

[4]Khan A，Das S C，Ramamurthy T，et al. Antibiotic resistance，virulence gene，and molecular profiles of Shiga toxin-producing Escherichia coli isolates from diverse sources in Calcutta，India[J]. Journal of Clinical Microbiology，2002，40（6）：2009-2015.endprint