阿維菌素高產(chǎn)菌株的誘變篩選及生產(chǎn)工藝的優(yōu)化

楊洋

摘要：阿維菌素是具有殺蟲、殺螨、殺線蟲的酯類化合物，廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代農(nóng)作物，本文通過(guò)運(yùn)用紫外線、亞硝基胍誘變的方式對(duì)阿維菌素的出發(fā)菌株SDSLAV-1進(jìn)行了誘變，篩選除了阿維菌素的高產(chǎn)菌株SDSLAV-02-01，其比出發(fā)菌株要高47%。

關(guān)鍵詞：阿維菌素 誘變篩選 工藝

阿維菌素具有安全、高效的農(nóng)藥特性，在常規(guī)用量下對(duì)人畜不會(huì)構(gòu)成傷害，因此阿維菌素具有廣泛的應(yīng)用空間，由于阿維菌素生產(chǎn)企業(yè)之間的競(jìng)爭(zhēng)加速，要求阿維菌素生產(chǎn)企業(yè)要降低生產(chǎn)成本，提高阿維菌素發(fā)酵單位與成品收率、優(yōu)化生產(chǎn)工藝。

1 阿維菌素誘變篩選的材料與方法

1.1 材料

1.1.1 出發(fā)菌株。阿維鏈霉菌由山東勝利生物工程有限公司提供，出發(fā)菌株經(jīng)過(guò)誘變之后得到SDSLAV-01、SDSLAV-02。

1.1.2 主要試劑。本實(shí)驗(yàn)采取的化學(xué)原料主要包括：玉米淀粉、高溫黃豆餅粉、花生餅粉、亞硝基胍、淀粉酶等。

1.1.3 主要儀器。實(shí)驗(yàn)中涉及到的儀器包括：PH機(jī)、超凈工作臺(tái)、搖床、顯微鏡、發(fā)酵罐、種子罐、結(jié)晶罐等。

1.1.4 培養(yǎng)基。培養(yǎng)基主要包括：一級(jí)種子罐培養(yǎng)基、二級(jí)種子罐培養(yǎng)基、發(fā)酵罐培養(yǎng)基，不同的培養(yǎng)基具有不同的配方。

1.2 誘變方法

1.2.1 紫外線誘變。首先取5ml配制好的阿維菌懸液放入直徑90mm的無(wú)菌培養(yǎng)罐中，并利用無(wú)菌的磁力棒進(jìn)行攪拌，然后放在功率為20W的紫外線下，打開無(wú)菌培養(yǎng)罐，進(jìn)行邊照射邊攪拌，然后按照不同的時(shí)間段，提出相同的阿維菌素液進(jìn)行不同程度的稀釋，最后放置在分離平板上，進(jìn)行7～9d的培養(yǎng)。

1.2.2 亞硝基胍誘變。使用濃度為108個(gè)/ml的磷酸緩沖液制備孢子懸液，分別用不同濃度的NTG處理紫外線誘變后的突變株單孢子懸液，在適當(dāng)?shù)臏囟拳h(huán)境下震動(dòng)30秒后，利用生理鹽清洗3遍后，至于分離平板，倒置培養(yǎng)7d。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外線篩選。經(jīng)過(guò)紫外線誘變培養(yǎng)之后，計(jì)算紫外線誘變的孢子死亡率，得出以下數(shù)據(jù)（見表1）。

通過(guò)表1可以清楚的獲悉袍子經(jīng)過(guò)90秒的紫外線篩選后，其死亡率達(dá)到了100%，隨機(jī)選擇單菌，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后在搖瓶中進(jìn)行發(fā)酵，之后利用相關(guān)儀器測(cè)量發(fā)酵效價(jià)，經(jīng)過(guò)反復(fù)篩選，獲得一支較為穩(wěn)定的突變株SDSLAV-02，其比出發(fā)菌株的產(chǎn)量要高34%。筆者將此作為下一步的誘變實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

2.2 亞硝基胍誘變篩選。通過(guò)對(duì)亞硝基胍誘變篩選的計(jì)算得出相關(guān)數(shù)據(jù)（見表2）。

表2 亞硝基胍誘變結(jié)果

由表2可見：在磷酸緩沖劑pH6.0環(huán)境下，NTG濃度在1mg/ml時(shí)死亡率最低，為4mg/ml時(shí)，其死亡率最高。同樣筆者隨機(jī)選取10個(gè)單菌培養(yǎng)后進(jìn)行發(fā)酵，然后測(cè)定菌株B1a組分效價(jià)，并且獲得各個(gè)濃度誘變滯后的正向突變率（見表3）。

表3 NTG誘變結(jié)果

同理，當(dāng)亞硝基胍濃度為1時(shí)其誘變效果最佳，其正向突變率達(dá)到了15，因此用低濃度的亞硝基胍誘變進(jìn)行菌株可以獲得SDSLAV-02-01。

3 阿維菌素發(fā)酵工藝的優(yōu)化

3.1 阿維菌素發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化。阿維菌素發(fā)酵不僅需要優(yōu)質(zhì)的高產(chǎn)菌株，還要有良好的培養(yǎng)基，因?yàn)榘⒕S菌素的發(fā)酵需要培養(yǎng)基給予提供必要的營(yíng)養(yǎng)，不同的培養(yǎng)基對(duì)阿維菌素的發(fā)酵會(huì)產(chǎn)生不同的效果。

3.1.1 碳源的優(yōu)化。為驗(yàn)證不同碳源對(duì)阿維菌素的發(fā)酵的影響，筆者采取不同的碳源作為培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)對(duì)象，根據(jù)實(shí)驗(yàn)獲悉，在相同條件下，玉米淀粉作為阿維菌素發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵單位最高，而且玉米淀粉的價(jià)格、儲(chǔ)存等各方面也比較合適，有利于企業(yè)節(jié)省生產(chǎn)成本，因此碳源的優(yōu)化來(lái)源為14%的玉米淀粉。

3.1.2 氮源的優(yōu)化。根據(jù)實(shí)驗(yàn)獲悉，高溫黃豆餅粉飾阿維菌素發(fā)酵生產(chǎn)水平最高的氮源，雖然高溫黃豆餅粉的單位含氮量不高，但是其發(fā)酵水平要高于其他氮源物質(zhì)，因此選擇高溫黃豆餅粉作為阿維菌素氮源。

3.2 阿維菌素發(fā)酵工藝控制的優(yōu)化

3.2.1 阿維菌素種子罐的指標(biāo)控制。阿維菌素種子罐分為一級(jí)種子罐和二級(jí)種子罐，一級(jí)種子罐的控制指標(biāo)是溶氧控制在20%，溫度為28℃，時(shí)間為30h；二級(jí)種子罐的指標(biāo)控制為接種量控制在10%，培養(yǎng)時(shí)間為20h。

3.2.2 發(fā)酵過(guò)程溶氧的控制。溶氧控制對(duì)發(fā)酵液的影響非常大，因?yàn)樵诎l(fā)酵前，培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)比較豐富，菌體的生長(zhǎng)速度非常得快，而隨著發(fā)酵時(shí)間的推進(jìn)，菌體消耗氧量就會(huì)增加，其溶氧就會(huì)下降，溶氧過(guò)低就會(huì)影響菌體的生長(zhǎng)。對(duì)此可以采取以下措施控制阿維菌素發(fā)酵溶氧問(wèn)題：一是通過(guò)控制發(fā)酵罐的攪拌轉(zhuǎn)速控制溶氧。隨著培養(yǎng)時(shí)間的推移，菌體的新陳代謝速度就會(huì)上升，菌絲的密度就會(huì)增加，其溶氧的密度就會(huì)越來(lái)越小，而通過(guò)控制轉(zhuǎn)速可以有效地解決溶氧問(wèn)題；二是調(diào)整通氣量。增加發(fā)酵罐的通氣量是增強(qiáng)阿維菌素發(fā)酵液的含氣率，有利于氧氣的傳遞。

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