鹽酸夫拉平度對人骨肉瘤細(xì)胞MG63細(xì)胞周期及凋亡的影響

李 潔,施佳辰,李嘯然,李月白#, 全碧波,宋 石,王義生

1)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室 鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 鄭州 450001 3)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科 鄭州 450052

鹽酸夫拉平度對人骨肉瘤細(xì)胞MG63細(xì)胞周期及凋亡的影響

李 潔1),施佳辰2),李嘯然1),李月白1)#, 全碧波1),宋 石1),王義生3)

1)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室 鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 鄭州 450001 3)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科 鄭州 450052

#通訊作者，女，1961年1月生，博士，教授，研究方向：腫瘤分子生物學(xué),E-mail：liyuebai@zzu.edu.cn

鹽酸夫拉平度；MG63；凋亡；CDK

目的：觀察不同濃度鹽酸夫拉平度(FP)對人骨肉瘤MG63細(xì)胞增殖活力、細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響。方法用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)MG63細(xì)胞，取對數(shù)生長期增殖旺盛細(xì)胞分為對照組和不同濃度FP干預(yù)組。MTT比色法測定不同濃度的FP對細(xì)胞增殖活性的影響；流式細(xì)胞術(shù)檢測不同濃度的FP干預(yù)24和48 h后細(xì)胞周期變化和凋亡情況；RT-PCR測定不同濃度FP干預(yù)后，細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)的變化；Western blot檢測細(xì)胞內(nèi)CDK2蛋白表達(dá)變化。結(jié)果50～2 000 nmol/L FP可抑制MG63細(xì)胞增殖活性，且有時間和濃度依賴性(F時間=319.470，F(xiàn)濃度=616.988，P均<0.001)；不同濃度的FP分別干預(yù)MG63細(xì)胞不同時間后均可引起細(xì)胞G2期阻滯(F24 h=6.805，F(xiàn)48 h=12.000，P均<0.001)，凋亡率增加(P均<0.001)，且可明顯降低MG63細(xì)胞中CDK2、Survivin mRNA及CDK2蛋白的表達(dá)(FmRNA=415.517、15.068，F(xiàn)蛋白=50.405，P均<0.001)。結(jié)論FP可抑制人骨肉瘤MG63細(xì)胞增殖及周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，同時使細(xì)胞G2/M期阻滯并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

骨肉瘤是一種原發(fā)惡性腫瘤，以青少年為主要發(fā)病人群，其具有很強(qiáng)的侵襲能力，發(fā)病迅猛，惡性程度高，病死率驚人[1]。惡性腫瘤強(qiáng)大的增殖能力導(dǎo)致其分化水平很低，同時，細(xì)胞周期蛋白依賴激酶(cyclin dependent kinase，CDK)-Cyclin蛋白復(fù)合物調(diào)節(jié)分化相關(guān)的關(guān)鍵基因，因此，以抑制CDK激酶活性為目標(biāo)的靶向藥物將有效控制細(xì)胞增殖能力，提高分化水平，同時能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[2-3]。CDK抑制劑夫拉平度(flavopiridol，F(xiàn)P)對多種CDK表達(dá)有抑制作用，因此，可產(chǎn)生明顯細(xì)胞周期阻滯作用，明顯抑制腫瘤[4]。有研究[5-6]報道，F(xiàn)P能夠明顯抑制EFTs細(xì)胞生長，同時，F(xiàn)P對耐藥肉瘤細(xì)胞具有同樣的作用。該研究選取具有典型腫瘤特征和良好代表性的MG63骨肉瘤細(xì)胞系為實驗對象，觀察不同濃度FP作用于MG63細(xì)胞后對細(xì)胞增殖活力以及細(xì)胞周期的影響。

1 材料與方法

1.1試劑FP、MTT、DMSO(美國Sigma公司)，人骨肉瘤細(xì)胞株MG63(北京協(xié)和細(xì)胞資源中心)，胰蛋白酶(美國Gibco公司),胎牛血清、DEPC、PCR擴(kuò)增試劑盒(加拿大Fermentas公司)，RPMI 1640培養(yǎng)液(北京索萊寶科技有限公司)，Annexin V-FITC試劑盒(南京凱基公司)，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2人骨肉瘤細(xì)胞系MG63的培養(yǎng)使用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RMPI 1640培養(yǎng)液，在細(xì)胞瓶內(nèi)接種細(xì)胞后置入37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)期、增殖旺盛細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)。

1.3細(xì)胞增殖活力的MTT法檢測取對數(shù)生長期的MG63細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞密度為2×104mL-1，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔200 μL。細(xì)胞貼壁之后，棄去培養(yǎng)液，然后加入含F(xiàn)P濃度依次為50、100、200、300、400、500和2 000 nmol/L的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞。對照組不加藥，并設(shè)置調(diào)零孔，每組設(shè)置6個復(fù)孔，分別培養(yǎng)24、48和72 h，之后每孔加入MTT，4 h之后棄去上清液，加入DMSO 150 μL，終止反應(yīng)。以調(diào)零孔光密度值(OD)調(diào)零校準(zhǔn)，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm波長處測各孔的OD值。生長抑制率=[1-(受試組OD值)/(對照組OD值)]×100%。

1.4不同濃度FP干預(yù)對MG63細(xì)胞周期的影響取對數(shù)增殖期細(xì)胞，制成2×10 mL-1單細(xì)胞懸液，接種于75 cm2培養(yǎng)瓶中，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，貼壁后，加入200和400 nmol/L FP的RPMI 1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)24和48 h，每個時間點(diǎn)都設(shè)置無藥對照組。收集細(xì)胞，加入體積分?jǐn)?shù)70%的冷乙醇固定，放于4 ℃冰箱過夜，次日用流式細(xì)胞儀對樣本進(jìn)行細(xì)胞周期分析。每組均設(shè)3個平行樣本。

1.5不同濃度FP干預(yù)對MG63細(xì)胞凋亡的影響細(xì)胞培養(yǎng)、分組同1.4。取1×106個細(xì)胞，2 000 r/min離心5 min，棄上清，加入1 mL PBS，重復(fù)以上操作。之后加入500 μL的Binding Buffer，輕輕振蕩使細(xì)胞懸浮，后依次加入10 μL Annexin V-FITC、5 μL PI 輕輕混勻，室溫避光反應(yīng)15 min。隨即用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。每組均設(shè)3個平行樣本。

1.6不同濃度FP干預(yù)對MG63細(xì)胞中CDK2和SurvivinmRNA表達(dá)的影響Trizol法提取總RNA，按RT-PCR試劑盒說明進(jìn)行操作。CDK2上游引物序列5’-CCGCCTGGACACTGAGACT-3’，下游引物序列5’-GTGGAGGACCCGATGGA-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為270 bp；Survivin上游引物序列5’-CAAGGAC CACCGCATCTC-3’，下游引物序列5’-CCAAGGGT TAATTCTTCAAACTG-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為255 bp。β-actin上游引物序列5’-CTGGGACGACATG GAGAAAA-3’，下游引物序列5’-AAGGAAGGCT GGAAGACTGC-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為540 bp。PCR的擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進(jìn)行35次循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，以目的基因與內(nèi)參條帶灰度值的比值為mRNA相對表達(dá)量。每組均設(shè)3個平行樣本。

1.7不同濃度FP干預(yù)對MG63細(xì)胞中CDK2蛋白表達(dá)的影響用100、200和300 nmol/L的FP干預(yù)MG63細(xì)胞5和10 d，以不加FP培養(yǎng)的細(xì)胞作對照，收集各培養(yǎng)瓶中細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。蛋白樣品以SDS-PAGE分離，然后通過半干轉(zhuǎn)印跡法轉(zhuǎn)移至NC膜上。將NC膜放入盛有50 g/L脫脂牛奶的托盤中，封閉2 h。封閉后的NC膜用TBS-T漂洗液進(jìn)行漂洗。然后加入1:200稀釋的一抗(TBS-T配制)，4 ℃孵育過夜。TBS-T漂洗膜3次，10 min/次；加入二抗(按照抗體說明書稀釋)，于室溫孵育1.5 h，TBS-T漂洗3次，10 min/次。用X光底片進(jìn)行顯影和定影并觀察。每組均設(shè)3個平行樣本。

1.8統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 18.0進(jìn)行分析。應(yīng)用析因設(shè)計的方差分析比較不同濃度FP培養(yǎng)不同時間后MG63細(xì)胞增殖抑制率、CDK2和Survivin mRNA及CDK2蛋白表達(dá)水平的變化，應(yīng)用多元方差分析法比較不同濃度FP培養(yǎng)24和48 h后MG63細(xì)胞周期的變化，應(yīng)用單因素方差分析和LSD-t檢驗比較不同濃度FP培養(yǎng)24和48 h后MG63細(xì)胞凋亡的變化，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1不同濃度FP干預(yù)不同時間后MG63細(xì)胞增殖活力的變化見表1。在24～72 h細(xì)胞增殖抑制率隨時間增長而增加；相同時間點(diǎn)，細(xì)胞增殖抑制率隨著藥物濃度(200～500 nmol/L)的增加而增加。

表1 不同濃度FP培養(yǎng)不同時間后MG63細(xì)胞增殖抑制率的變化(n=3) %

F濃度=616.998，F(xiàn)時間=319.470，F(xiàn)交互=18.234，P均<0.001。

2.2不同濃度FP培養(yǎng)24和48h后MG63細(xì)胞周期的變化見表2。結(jié)果提示FP作用24和48 h均可引起MG63細(xì)胞周期于G2/M期阻滯，并且在一定濃度范圍內(nèi)，藥物濃度與阻滯效應(yīng)呈正比。

表2 不同濃度FP作用MG63細(xì)胞24和48 h對細(xì)胞周期分布的影響(n=3) %

多元方差分析顯示：F24 h=6.805，P=0.004；F48 h=12.000，P<0.001。

2.3不同濃度FP培養(yǎng)24和48h后MG63細(xì)胞凋亡的變化見表3。

表3 不同濃度FP培養(yǎng)24和48 h后MG63細(xì)胞凋亡的變化(n=3) %

*:與0 nmol/L組相比，P<0.05；#：與200 nmol/L組相比，P<0.05。

2.4不同濃度FP培養(yǎng)不同時間后MG63細(xì)胞中CDK2和SurvivinmRNA表達(dá)水平的變化見表4、5。

表4 不同濃度FP培養(yǎng)不同時間后MG63細(xì)胞中CDK2 mRNA表達(dá)水平的變化(n=3)

F濃度=3 289.631，F(xiàn)時間=204.705，F(xiàn)交互=415.517，P均<0.001。

表5 不同濃度FP培養(yǎng)不同時間后MG63細(xì)胞中Survivin mRNA表達(dá)水平的變化(n=3)

F濃度=719.683，F(xiàn)時間=160.228，F(xiàn)交互=15.068，P均<0.001。

2.5不同濃度FP培養(yǎng)不同時間后MG63細(xì)胞中CDK2蛋白水平的變化見圖1、表6。

圖1 不同濃度FP培養(yǎng)不同時間后MG63細(xì)胞中CDK2蛋白水平的變化

表6 不同濃度FP培養(yǎng)不同時間后MG63細(xì)胞中CDK2蛋白水平的變化(n=3)

F濃度=382.862，F(xiàn)時間=547.093，F(xiàn)交互=50.405，P均<0.001。

3 討論

骨肉瘤是一種原發(fā)性惡性骨腫瘤，其較強(qiáng)的侵襲能力并可發(fā)生早期轉(zhuǎn)移成為骨肉瘤致死的主要原因[7]。由于發(fā)病機(jī)制尚未明確，目前仍無有效的治療手段，所以骨肉瘤患者預(yù)后差。因此，闡明其發(fā)病機(jī)制并找到有效治療靶點(diǎn)刻不容緩。

根據(jù)目前的研究結(jié)果顯示，骨肉瘤遺傳學(xué)上涉及了多個染色體區(qū)帶發(fā)生缺失、增加和重排，并存在rb、p53、cMyc等多個基因參與的信號通路脫調(diào)控。其中Rb蛋白作為細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因子之一，可在低度磷酸化狀態(tài)時與轉(zhuǎn)錄因子E2F結(jié)合阻止細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，而這一過程與CDKs有著微妙的關(guān)系。

FP是一種半合成黃酮類衍生物，最初由藥用植物提煉，已有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)P可在除骨肉瘤細(xì)胞外的多種腫瘤細(xì)胞(如乳癌細(xì)胞)中抑制CDKs(CDK1、CDK2、CDK3、CDK4等)的活性，使細(xì)胞阻滯于G1、G2期，并可以有效誘導(dǎo)多種體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[8-9]。此外，F(xiàn)P還可通過影響細(xì)胞內(nèi)其他關(guān)鍵基因，如cyclin B、VEGF、survivin、bcl-2、cyclin D、p21等的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，上調(diào)HIF-1、E2F1和P53等蛋白表達(dá)水平等途徑對細(xì)胞產(chǎn)生影響[10]。

該實驗研究顯示，在骨肉瘤細(xì)胞中，F(xiàn)P濃度在200～500 nmol/L范圍內(nèi)時作用于MG63細(xì)胞可抑制細(xì)胞生長并誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，且抑制率和凋亡率隨濃度增大而升高，具有濃度、時間依賴性。作者用200和400 nmol/L的FP分別作用于MG63細(xì)胞24和48 h后均引起不同程度的G2期阻滯，并伴隨著CDK2表達(dá)量的下調(diào)。眾所周知，F(xiàn)P對于CDKs具有廣泛的抑制作用，因此推測骨肉瘤MG63細(xì)胞中的這一現(xiàn)象與CDK2的表達(dá)下調(diào)密切相關(guān)。此外，該研究根據(jù)FP能夠降低Survivin表達(dá)，推斷FP誘導(dǎo)MG63細(xì)胞凋亡可能與調(diào)控Survivin的表達(dá)有關(guān)，通過作用于凋亡信號通路下游，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，該實驗闡明了FP可通過抑制CDK2和Survivin的表達(dá)使人骨肉瘤MG63細(xì)胞發(fā)生周期阻滯和誘導(dǎo)其凋亡，研究結(jié)果為臨床骨肉瘤的治療提供了新的實驗依據(jù)，也對FP的抗腫瘤應(yīng)用提供了可靠理論價值。

[1]趙意華,陳清漢,華海嬰,等.氯化鋰對人骨肉瘤細(xì)胞U2-OS增殖、凋亡及Fas、Caspase-3 mRNA表達(dá)的影響[J].鄭州大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版,2012,47(4):502

[2]Carassou P,Meijer L,Le Moulec SA,et al.Cell cycle and molecular targets: CDK inhibition[J].Bull Cancer,2012,99(2):163

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[5]王孟昌,張斌.Flavopiridol誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制[J].西安交通大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版,2011,32(2):201

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[7]劉志禮,尹慶水,舒勇,等.Aurora-B、Ki-67在骨肉瘤中的表達(dá)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的關(guān)系[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志,2011,36(11):1197

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(2013-09-22收稿 責(zé)任編輯趙秋民)

Flavopiridol suppresses cell cycle and induces apoptosis in human osteosarcoma MG63 cell line

LIjie1),SHIJiachen2),LIXiaoran1),LIYuebai1),QUANBibo1),SONGShi1),WANGYisheng3)

1)DepartmentofBiochemistry，CollegeofBasicMedicalSciences，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450001

2)CollegeofBasicMedicalSciences，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450001 3)DepartmentofOrthopedicSurgery，theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052

flavopiridol；MG63；apoptosis；CDK

Aim: To investigate the influence of flavopiridol(FP) on proliferation, cell cycle and cell apoptosis in human osteosarcoma MG63 cell lines. Methods: The cells were cultured with RPMI1640 medium containing 10% of fetal bovine serum as usual, and treated with different concentration FP. MTT assay was used to detect the influence of different dose FP treatment on cell proliferation. Flow cytometry (FCM) was used to determine the cycle distribution and apoptosis status of the cells which treated with various concentration FP for 24 and 48 h respectively.RT-PCR was used to test the mRNA expression of cell cycle related genes after the FP intervention.The protein expression of CDK2 in cells after FP treatment was detected by Western blot. Results: FP could inhibit the cell proliferation in the range of 50 to 2 000 nmol/L, the inhibition rate also increased with time at the range from 24 to 72 h(Fconcentration=616.988,Ftime=319.470，P<0.001). The different concentrations of FP that respectively acting on the MG63 cells for different times could arrested MG63 cells at G2phase obviously (F24 h=6.805，F(xiàn)48 h=12.000，P<0.001) and increased apoptosis rate(P<0.001), and could also decrease the mRNA level of CDK2 and Survivin obviously in MG63 cells and down-regulate the expression of CDK2 protein as well(FmRNA=415.517，15.068，F(xiàn)protein=50.405，P<0.001). Conclusion: The CDK inhibitor flavopiridol can inhibit the cell proliferation and the expression of cell cycle related protein in human osteosarcoma MG63 cell, and induce the cell G2/M phase arrest and the cell apoptosis.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.04.020

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