煤焦瀝青煙提取物對(duì)BEAS-2B細(xì)胞環(huán)氧化酶-2 mRNA表達(dá)的影響*

楊維超，逯 洋,李 娟，晉樂(lè)飛,劉文佳，燕 貞，吳衛(wèi)東

1)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生學(xué)教研室 鄭州 450001 2)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)教研室 新鄉(xiāng) 453003

煤焦瀝青煙提取物對(duì)BEAS-2B細(xì)胞環(huán)氧化酶-2mRNA表達(dá)的影響*

楊維超1)，逯 洋1),李 娟1)，晉樂(lè)飛1),劉文佳1)，燕 貞1)，吳衛(wèi)東2)#

1)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生學(xué)教研室 鄭州 450001 2)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)教研室 新鄉(xiāng) 453003

#通訊作者，男，1963年10月生，博士，教授，研究方向：分子毒理學(xué)，E-mail:xxmu2013@gmail.com

煤焦瀝青煙提取物；人支氣管上皮細(xì)胞；環(huán)氧化酶-2

目的：探討煤焦瀝青煙提取物(CTPE)對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞環(huán)氧化酶-2(COX-2) mRNA表達(dá)的影響。方法應(yīng)用RT-PCR方法測(cè)定不同質(zhì)量濃度(2、4、8 mg/L)CTPE作用不同時(shí)間(2、4、8 h)對(duì)人支氣管上皮BEAS-2B細(xì)胞COX-2 mRNA表達(dá)水平影響。使用放線菌素(Act)D(1 mg/L)作用于BEAS-2B細(xì)胞，觀察其對(duì)2 mg/L CTPE作用30 min后的BEAS-2B細(xì)胞COX-2基因轉(zhuǎn)錄的影響。利用ZnSO4溶液刺激BEAS-2B細(xì)胞COX-2 mRNA表達(dá)，去除ZnSO4后，加入1 mg/L的Act D 30 min，檢測(cè)CTPE 作用不同時(shí)間點(diǎn)(0、2、4 h)的COX-2 mRNA表達(dá)的變化。結(jié)果2、4、8 mg/L CTPE刺激均可以使BEAS-2B細(xì)胞COX-2 mRNA表達(dá)水平升高(F組間=71.750,F時(shí)間=93.120,F交互=17.300，P<0.001), 2 mg/L是最佳劑量。用Act D(1 mg/L)預(yù)處理細(xì)胞30 min，可降低CTPE對(duì)COX-2 mRNA表達(dá)的誘導(dǎo)作用(FAct D=174.203,FCTPE=260.312,F交互=188.521，P<0.001)。使用ZnSO4刺激，然后使用Act D終止COX-2 mRNA合成后，不同時(shí)間點(diǎn)，CTPE組和對(duì)照組COX-2 mRNA的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F組間=365.700,F時(shí)間= 37.780,F交互=6.240，P<0.001)。結(jié)論CTPE可以通過(guò)轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞COX-2 mRNA的表達(dá)。

煤焦瀝青是煤炭煉焦過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)品,具有致癌性，可以誘發(fā)肺癌。肺癌是最為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，細(xì)胞中環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)的過(guò)度表達(dá)與肺癌的發(fā)生密切相關(guān)。COX-2是誘導(dǎo)型酶，當(dāng)細(xì)胞受到細(xì)胞因子、化學(xué)致癌物、內(nèi)毒素等刺激作用后開(kāi)始表達(dá)。研究[1-4]顯示COX-2是促癌的一種關(guān)鍵因子。作者以人支氣管上皮BEAS-2B細(xì)胞作為研究對(duì)象，測(cè)定煤焦瀝青煙提取物(coal tar pitch extract，CTPE)對(duì)BEAS-2B細(xì)胞COX-2 mRNA表達(dá)影響。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞和主要試劑中溫煤焦瀝青(安陽(yáng)鋼鐵公司煉焦車間提供，常溫保存)，CTPE溶液由課題組前期制備[5]，BEAS-2B細(xì)胞(購(gòu)自美國(guó)ATCC公司)為猴空泡病毒40永生化正常人支氣管上皮細(xì)胞，DMSO(天津市化學(xué)試劑三廠)，EB(北京索萊寶生物科技有限公司)，硫酸鋅(ZnSO4,上海化學(xué)試劑廠總廠所屬上海試劑廠二廠)，溴酚藍(lán)、PBS粉劑(北京索萊寶生物科技有限公司)，尼康YS100顯微鏡(日本Nikon公司)，723可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司)，MX3000-RT-PCR儀(日本SANYO公司)，超凈工作臺(tái)(廣東康力醫(yī)藥有限公司)。

1.2分組與處理采用BEAS-2B細(xì)胞半數(shù)抑制濃度作為最大染毒濃度，根據(jù)前期課題組實(shí)驗(yàn)結(jié)果[5]，實(shí)驗(yàn)設(shè)置2、4、8 mg/L染毒組和溶劑對(duì)照組，染毒組采用對(duì)應(yīng)濃度的CTPE溶液處理，溶劑對(duì)照組采用體積分?jǐn)?shù)0.1% DMSO處理。每個(gè)劑量組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，分別作用2、4、8 h。

1.3COX-2mRNA表達(dá)的檢測(cè)采用RT-PCR方法。收集細(xì)胞，提取RNA，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。對(duì)逆轉(zhuǎn)錄的cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)定量RT-PCR擴(kuò)增。 反應(yīng)體系為：SYBR Premix Ex TaqⅡ 12.5 μL,上、下游引物各1 μL，模板cDNA 2 μL，與DEPC水混勻，終體積為25 μL。反應(yīng)條件為:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 50 s，循環(huán)40輪;最后72 ℃延伸10 min。β-actin作為內(nèi)參，用比較閾值法[5]計(jì)算COX-2 mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.4放線菌素(Act)D轉(zhuǎn)錄抑制實(shí)驗(yàn)將BEAS-2B細(xì)胞接種于12孔培養(yǎng)板，設(shè)DMSO對(duì)照組和 CTPE組、Act D 對(duì)照組和CTPE組，每組3孔。細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，DMSO對(duì)照組和 CTPE組加入1 mg/L DMSO，Act D 對(duì)照組和CTPE組加入1 mg/L Act D， 作用30 min后，再分別向DMSO CTPE組和Act D CTPE組加入2 mg/L CTPE。作用4 h后收集細(xì)胞,用1 mL Trizol提取細(xì)胞 RNA。用RT-PCR法檢測(cè)COX-2 mRNA水平。

1.5CTPE對(duì)COX-2mRNA穩(wěn)定性的影響采用COX-2 mRNA降解測(cè)定法。BEAS-2B細(xì)胞接種于12孔培養(yǎng)板上，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，加入陽(yáng)性刺激物(ZnSO4)作用BEAS-2B細(xì)胞12 h[6]，然后去除ZnSO4，各孔中加入1 mg/L Act D，溫育30 min之后將細(xì)胞分為對(duì)照組(DMSO)和CTPE (2 mg/L)刺激組。CTPE作用0、2、4 h后收集細(xì)胞，用Trizol提取細(xì)胞RNA，用RT-PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞COX-2 mRNA的表達(dá)水平。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 17.0分析。Act D對(duì)BEAS-2B細(xì)胞COX-2 mRNA表達(dá)抑制的影響和CTPE對(duì)BEAS-2B細(xì)胞COX-2 mRNA表達(dá)的影響及mRNA穩(wěn)定性的比較采用析因設(shè)計(jì)的方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1各組BEAS-2B細(xì)胞COX-2mRNA表達(dá)的比較結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組BEAS-2B細(xì)胞COX-2 mRNA表達(dá)的比較(n=3)

F組間=71.750,F時(shí)間=93.120,F交互=17.300，P均<0.001。

2.2ActD轉(zhuǎn)錄抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3CTPE對(duì)COX-2mRNA穩(wěn)定性的影響結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 Act D轉(zhuǎn)錄抑制實(shí)驗(yàn)

FAct D=174.203,FCTPE=260.312,F交互=188.521，P<0.001。

表3 不同時(shí)間兩組BEAS-2B細(xì)胞COX-2 mRNA的表達(dá)量(n=3)

F組間=365.700,F時(shí)間= 37.780,F交互=6.240，P均<0.001。

3 討論

目前關(guān)于COX-2基因表達(dá)影響各種疾病發(fā)生發(fā)展國(guó)內(nèi)外的報(bào)道較多。Hida等[7]發(fā)現(xiàn)70%的肺惡性腺瘤組織中COX-2高表達(dá)。趙媛等[8]在原發(fā)性肝細(xì)胞癌組織中發(fā)現(xiàn)COX-2 蛋白高表達(dá)。Khuri等[9]應(yīng)用原位雜交技術(shù)對(duì)160例1期非小細(xì)胞肺癌患者進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)COX-2的過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致早期患者生存率的下降。而目前煤焦瀝青是否可誘導(dǎo)永生化人支氣管上皮細(xì)胞COX-2表達(dá)的相關(guān)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

該研究結(jié)果顯示，隨著CTPE劑量升高，COX-2 mRNA表達(dá)量逐漸下降。分析原因，可能由于CTPE細(xì)胞毒性較大， 8 mg/L為其半數(shù)抑制濃度[5]，可能超出了細(xì)胞能夠承載的毒物濃度，所以COX-2 mRNA表達(dá)下降。而隨著時(shí)間的推移，COX-2 mRNA表達(dá)先升高后降低，提示COX-2 mRNA有可能會(huì)參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)，即表達(dá)升高后一段時(shí)間內(nèi)被降解，這與Wu等[6]的研究結(jié)果一致。CTPE刺激可能提高了BEAS-2B細(xì)胞內(nèi)COX-2 mRNA的轉(zhuǎn)錄活性。該研究中，染毒濃度2 mg/L、染毒時(shí)間為4 h時(shí)，CTPE對(duì)BEAS-2B細(xì)胞COX-2 mRNA表達(dá)的影響比較明顯，因此采用這一實(shí)驗(yàn)條件，用轉(zhuǎn)錄抑制劑Act D預(yù)處理細(xì)胞30 min，觀察其對(duì)CTPE誘導(dǎo)COX-2 mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果表明，Atc D可顯著抑制CTPE對(duì)BEAS-2B細(xì)胞COX-2的誘導(dǎo)作用，進(jìn)而也提示轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機(jī)制參與了CTPE對(duì)BEAS-2B細(xì)胞COX-2表達(dá)的誘導(dǎo)作用。

由于mRNA的穩(wěn)定作用是轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中一種重要機(jī)制[10-14]，所以作者通過(guò)采用mRNA降解試驗(yàn)觀察CTPE對(duì)COX-2 mRNA的穩(wěn)定作用，從而證實(shí)CTPE是否在轉(zhuǎn)錄后層面上影響COX-2 mRNA 的表達(dá)。該研究結(jié)果表明CTPE能在轉(zhuǎn)錄后維持COX-2 mRNA高水平表達(dá)，其機(jī)制可能是CTPE能夠減緩COX-2 mRNA的降解速度，提升其穩(wěn)定性。

綜上所述，CTPE可能在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后的水平誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞COX-2 mRNA的表達(dá)增加，具體機(jī)制需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

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(2013-11-17收稿 責(zé)任編輯李沛寰)

Effect of coal tar pitch smoke extract on cyclooxygenase-2 mRNA expression in human bronchial epithelial cells

YANGWeichao1),LUYang1),LIJuan1),JINLefei1),LIUWenjia1),YANZhen1),WUWeidong2)

1)DepartmentofOccupationalHealth,CollegeofPublicHealth，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450001

2)DepartmentofOccupationalHealthandEvironmentalHealth,SchoolofPublicHealth,XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453003

coal tar pitch extract; human bronchial epithelial cells; cyclooxygenase-2

Aim: To examine the effect of coal tar pitch smoke extract(CTPE) on COX-2 gene expression in human bronchial epithelial cells. Methods:The human bronchial epithelial cell line (BEAS-2B) was used as an in vitro model. CTPE induced COX-2 mRNA expression were measured by RT-PCR. Actinomycin D，a transcription inhibitor, was applied to test the effect of CTPE on COX-2 gene transcription. mRNA decay assay was used to observe the effect of CTPE on COX-2 mRNA stability at post transcriptional level. Results: CTPE stimulation increased COX-2 mRNA expression in BEAS-2B cells(Fgroup=71.750,Ftime=93.120,Finteraction=17.300，allP<0.001). Pretreatment of BEAS-2B cells with Actinomycin D (1 mg/L),for 30 min could significantly reduce the effect of CTPE on COX-2 mRNA expression (FAct D=174.203,FCTPE=260.312,Finteraction=188.521，P<0.001). Actinomycin D was used to terminate COX-2 mRNA synthesis elevated by zinc sulfate. At different time points (0, 2, 4 h) COX-2 mRNA levels were higher in CTPE group than those in control group(Fgroup=365.700,Ftime=37.780,Finteraction=6.240,allP<0.05). Conclusion: CTPE stimulation can significantly increase COX-2 mRNA expression levels in BEAS-2B cells.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.04.013

*國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 81001240

R995