胃癌患者術中腹腔沖洗液MMP-2mRNA、MMP-14 mRNA檢測的臨床意義

王一波,譚玉林,孫亞偉,湯黎明

(1.江蘇大學附屬武進醫(yī)院 普外科,江蘇 常州,213017;2.南京醫(yī)科大學附屬常州市二院 普外科,江蘇 常州,213002)

胃癌是消化道常見惡性腫瘤之一，其死亡率居高不下，而腹腔轉移是胃癌最主要的復發(fā)轉移方式之一，統(tǒng)計表明在進展期胃癌術后腹膜轉移占40%～50%[1]。因此對胃癌腹腔轉移進行早期診斷，是提高胃癌治療效果的的重要途徑。胃癌腹膜轉移是由眾多相關因素共同參與的過程，目前文獻報道研究的相關因素有CK19mRNA、CK20 mRNA、COX-2mRNA、CEA mRNA等[2-3],而基質金屬蛋白酶方面的研究少有報道，本文就采用實時熒光定量RT-PCR方法檢測胃癌患者腹腔沖洗液MMP-2mRNA及MMP-14mRNA的表達,來探討其在腹腔轉移中的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 研究對象

經本院倫理學會批準選擇臨床及病理資料完整的江蘇大學附屬武進醫(yī)院普外科2008年1月—2009年12月手術切除并經病理證實為胃癌患者98例。所有患者術前均未進行化療，放療或生物治療,術前及術后病理學檢查均診斷為胃癌。其中男60例，女38例；年齡23～82歲,46例年齡≥60歲，52例<60歲，平均(61.3±12.5)歲；腫瘤的原發(fā)灶大小、浸潤深度、淋巴結轉移均由病理觀察確定，遠處轉移由病理學和臨床聯(lián)合確定。根據1990年世界衛(wèi)生組織(WHO)腫瘤分化程度判斷標準將胃癌患者分為高、中、低分化組,其中高分化組8例;中分化組50例,低分化組40例。胃癌分期采用2002年國際抗癌聯(lián)盟制定的TNM分期標準,其中Ⅰ/Ⅱ期患者36例,Ⅲ/Ⅳ期患者62例。Borrmann分型為Ⅰ/Ⅱ型者54例,Ⅲ/Ⅳ型者44例。腫瘤直徑≥5 cm者33例,<5 cm者65例。淋巴結轉移陽性者71例,淋巴結轉移陰性者巧27例。腫瘤浸潤深度局限在漿膜層及漿膜內者犯66例,累及漿膜層外者32例。腹腔內轉移轉移者28例,無轉移者70例。腹腔沖洗液陰性對照組為30例良性病變。胃癌免疫組織化學法對照組例數為20例，為良性胃病變黏膜組織。

標本采集：所有胃癌病例均采集術前腹腔沖洗液,向腹腔內注入無菌生理鹽水100 mL,收集后TRIZOL法提取腹腔沖洗液標本中的總RNA,取少量RNA用于含量及純度測定,其余分裝后置-80 ℃保存待用。另收集30例良性病變病人腹腔沖洗液作為陰性對照。

1.2 材料與主要儀器

主要試劑: M-MLV反轉錄酶(Promega M1705),SunShineBioTM總RNA提取試劑(SunShineBio SN114),GoTaq qPCR Master Mix(promega A6001),Oligo dT18(SunShineBio),Random prime (SunShineBio),RNase Inhibitor (SunShineBio R0004),dNTP (SunShineBio D0056)。

1.3 實驗方法

RT-PCR實驗：從組織中提取總RNA。RT-PCR反應的實驗操作步驟：取滅過菌且無核酸酶的0.2 mL PCR管,依次加入無核酸酶的雙蒸水至總體積13.5 μL; 65 ℃保溫5 min,然后冰浴5 min; 0.2 mL PCR管依次加入下列組分至總體積20 μL; 先在37 ℃保溫1 h,然后70 ℃保溫15 min; SYBR Green RT-PCR實驗步驟：為減少干擾，每個cDNA樣本都稀釋10倍(5 μL cDNA+45 μL H2O)引物mix(引物的F和R在同一管中)，濃度各為2 μm。一個樣本做3個復孔；反應體系：短暫離心，確保所有反應液在反應孔底部。反應條件: 95 ℃預變性10 s,95 ℃變性5 s,60 ℃退火延伸31 s,共40個循環(huán)。熔解曲線分析。按照上述實驗方法進行出來數據，閾值與Ct值由ABI Sequence Detection System軟件自動得出。數據分析Real-time PCR輸出的結果是Ct值，樣本的MMP-2或MMP-14的Ct值-內參GAPDH的Ct值為△Ct,MMP-2或MMP-14的表達量即為2-vCt×1000。

引物設計基因名稱引物序列片段長度Beta-actinF,5′-CAGTCGGTTGGAGCGAGCAT-3′R,5′-GGACTTCCTGTAACAACGCATCT-3′115 bpMMP-2F,5′GCTGCAACCTGTTTGTGCTGA-3′R,5′-TCCGCATGGTCTCGATGGTA-3′105 bpMMP-14F,5′-CATTGGAGGAGACACCCACTTTG-3′R,5′-CCAGGAAGATGTCATTTCCATTCAG-3′83 bp

2 結 果

2.1 Real-timeRT-PCR檢測各目的基因在腹腔沖洗液中的表達

Real-timeRT-PCR檢測各指標在腹腔沖洗液中的表達陽性率，見表1。

表1 MMP-2mRNA和MMP-14mRNA的表達

2.2 MMP-2mRNA表達與胃癌腹膜轉移相關臨床病理因素比較

通過統(tǒng)計分析可見，在胃癌腹腔液中MMP-2mRNA的表達陽性率隨著腫瘤浸潤深度的加深而顯著增加(P<0.01); MMP-2mRNA表達的陽性率還與腹腔內是否轉移有關,腹腔內轉移的要明顯高于無腹腔內轉移者(P<0.01); 并與胃癌的大體類型有關,Borr3+Borr4型要明顯高于Borrl+Borr2型(P<0.01),見表2。

表2 MMP-2mRNA表達與胃癌腹膜轉移相關臨床病理因素比較[n(%)]

2.3 MMP-14mRNA表達與胃癌腹膜轉移相關臨床病理因素比較

通過統(tǒng)計分析可見,在胃癌腹腔液中MMP-14mRNA的表達陽性率隨著腫瘤浸潤深度的加深而顯著增加(P<0.01); MMP-14mRNA表達的陽性率還與腹腔內是否轉移有關,腹腔內轉移的要明顯高于無腹腔內轉移者(P<0.01); 并與胃癌的大體類型有關,Borr3+Borr4型要明顯高于Borrl+Borr2型(P<0.01),見表3。

表3 MMP-14mRNA表達與胃癌腹膜轉移相關臨床病理因素比較[n(%)]

2.4 腹腔沖洗液中MMP-2mRNA及MMP-14mRNA之間表達的相關性

腹腔沖洗液中MMP-2mRNA及MMP-14mRNA表達水平進行相關性分析,由表4可知MMP-2mRNA及MMP-14mRNA在胃癌患者腹腔沖洗液中的表達呈正相關,(χ2=28.222,P=0.000,r=0.437)。

表4 腹腔沖洗液中MMP-2mRNA及MMP-14mRNA表達的相關性

3 討 論

胃癌是中國人群中發(fā)病率和死亡率均占第一位的惡性腫瘤,腹腔轉移是胃癌無法手術根治的主要原因之一,也是術后復發(fā)治療失敗的主要原因[4]。腹腔內脫落的癌細胞是形成腹腔轉移的基礎，其關鍵步驟是腫瘤細胞穿越由細胞外基質(ECM)和基底膜(BM)組成的屏障是,Liu等[5]研究表明癌細胞可產生大量溶解酶降解基質或基底膜，這些溶解酶與癌侵襲轉移能力顯著相關，溶解酶系統(tǒng)由一龐大的蛋白溶解酶家族構成,被稱為基質金屬蛋白酶(MMPs),它是一組鋅離子依賴性蛋白水解酶,因需要Ca2+、zn2+等金屬離子作為輔助因子來發(fā)揮活性而得名[6],是一多基因家族，是人體內降解ECM的主要酶類,是一類與腫瘤浸潤和轉移密切相關的生物酶,MMPs可以通過降解ECM、調節(jié)細胞凋亡、增加細胞黏附能力、促進新血管生成來促進腫瘤細胞的生長、侵襲和轉移,從而參與腫瘤演進等眾多生理和病理過程[7]。Real-time PCR是近年來使用的一種檢測技術,因高精確度、高靈敏度、污染少等優(yōu)點已在生物醫(yī)學、基礎科研及臨床醫(yī)學中得到廣泛應用。Kodera等[8]采用RT-PCR檢測195例胃癌患者的腹腔沖洗液CEA mRNA及CK20 mRNA,結果CEA mRNA陽性率為22%,CK20mRNA陽性率為23%,均高于腹腔灌洗細胞學檢查的陽性率(16%)。在各種分子生物學檢測方法中,RT-PCR方法具有較高的靈敏度，從而使得胃癌腹腔微轉移檢測成為可能，在98例胃癌腹腔沖洗液中檢測各目的基因的表達，定量范圍寬廣直觀,是檢測基因表達最理想的方法。本實驗中,通過擴增產物的熔解曲線分析，可見窄而尖的熔點峰，表明實驗中無污染，引物二聚體和非特異性擴增，產物純度高,可見該反應體系完好,PCR擴增特異性高,可信度高，可用于統(tǒng)計學分析。

目前尚無公認的胃癌特異性腫瘤標志物或基因，這極大地降低了腹膜微轉移檢查的臨床價值。所以目前尋找靈敏性與特異性更好的分子標志物，能夠有效地提高腹腔內脫落腫瘤細胞的檢出率成為關鍵的任務。本實驗在MMPs中選取具有代表性的與胃癌臨床病理關系密切相關的2種標志物基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)和基質金屬蛋白酶-14(MMP-14),研究它們在胃癌腹腔轉移中的作用機制。MMP-2基因位于染色體16q21,由13個外顯子和12個內含子所組成，結構基因總長度為27 kb,MMP-2基因編碼分子量約72 kd的酶原，經活化后水解為65 kd的活性形式。MMP-2是一種Ⅳ型膠原酶和明膠酶，可以降解細胞基質以及Ⅳ型膠原，形成局部溶解區(qū)以構成腫瘤細胞移動的通道[9]。其生理功能主要是參與傷口愈合,生殖以及生殖器官的復舊等。正常成人組織中它的水平較低，只有在系統(tǒng)接受一個刺激或病理狀態(tài)下其水平才會升高[10]。

MMP-14屬于膜型基質金屬蛋白酶，膜型MMP分子均有前肽PRCGVPD高度保守序列、Zn2+結合位點、富含脯氨酸的鉸鏈區(qū)及3個獨特的插入序列。多數膜型MMP既是MMP的受體,也是MMP的激活劑,而且可降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ型膠原和纖維粘連蛋白。以往研究發(fā)現,在一些其他組織中,MMP-14是通過形成MMP-14/TIMP-2/pro-MMP-2三重復合物來激活MMP-2。

在本研究中，作者采用RT-PCR方法,對98例胃癌患者的腹腔沖洗液進行上述標志物mRNA表達的并行檢測,并取30例良性病變腹腔沖洗液作為陰性對照。本實驗結果顯示,98例胃癌腹腔沖洗液中,MMP-2mRNA陽性率為42.9%(42/98),MMP-14mRNA陽性率為40.8%(40/98),而陰性對照組分別為1/30(3.33%)、2/30(6.67%)、0/30(0%)、1/30(3.33%),胃癌組遠高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),顯示了良好的敏感性。

通過統(tǒng)計分析可見,在胃癌腹腔液中MMP-2、MMP-14的表達陽性率與胃癌生長方式有關，隨著腫瘤浸潤深度的加深而顯著增加(P<0.01),亦隨著漿膜類型的惡變而顯著增加(P<0.05); 兩種基因的mRNA表達的陽性率還與腹腔內是否轉移有關，腹膜轉移的要明顯高于無腹膜轉移者(P<0.01); 并與胃癌的大體類型有關,Borr3+Borr4型要明顯高于Borrl+Borr2型(P<0.01)。本研究還進一步分析了胃癌腹腔液中MMP-2、MMP-14的表達與胃癌腹膜轉移的關系。這2種標志物的表達隨著腫瘤浸潤深度的增加而顯著增加，亦隨著漿膜類型的惡變而顯著性增加，說明這2種標志物與胃癌腹膜轉移過程是密切相關的，提示該方法適用于胃癌腹膜轉移的預測和亞臨床轉移的篩檢。

本實驗通過統(tǒng)計分析腹腔沖洗液中MMP-2和MMP-14之間表達的相關性,98例胃癌腹腔沖洗液中MMP-2和MMP-14表達正相關性(r=0.473,P<0.01); 說明MMP-2與MMP-14在胃癌的浸潤轉移過程中,具有正協(xié)同作用。

因此通過Real-timeRT-PCR方法檢測胃癌患者腹腔沖洗液中目的基因mRNA來預測腹腔中的腫瘤細胞是可靠的,具有較高的敏感性和特異性，可及早發(fā)現常規(guī)檢查所不能及的微轉移灶。

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