高效液相色譜法檢測(cè)雞肉中氟喹諾酮類藥物殘留量前處理方法的優(yōu)化

李維鋮，姬長云，張靜潔，程漢奎，鄧 超，鐘佳蓮，鄧銜柏，沈祥廣

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510642)

高效液相色譜法檢測(cè)雞肉中氟喹諾酮類藥物殘留量前處理方法的優(yōu)化

李維鋮，姬長云，張靜潔，程漢奎，鄧 超，鐘佳蓮，鄧銜柏，沈祥廣

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510642)

【目的】建立一種用高效液相色譜法快速檢測(cè)雞肉組織中5種氟喹諾酮類藥物(諾氟沙星、環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星)殘留量的方法.【方法】樣品的提取液由乙腈與三氯乙酸溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%)按體積比 1∶3的比例混合而成，流動(dòng)相為乙腈-磷酸/三乙胺溶液(0.02 mol·L-1)，熒光激發(fā)波長280 nm，發(fā)射波長450 nm.【結(jié)果和結(jié)論】添加低、中、高濃度水平時(shí)，回收率為84.71%～99.66%，變異系數(shù)為0.20%～4.34%.該方法檢測(cè)諾氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星的殘留定量限為10 μg ·kg-1，達(dá)氟沙星的殘留定量限為2 μg ·kg-1，沙拉沙星的殘留定量限為20 μg ·kg-1.此法操作簡(jiǎn)單、實(shí)用，靈敏度高，可以滿足雞肉食品中氟喹諾酮類藥物殘留檢測(cè)的需要.

高效液相色譜法； 氟喹諾酮類藥物； 雞肉； 藥物殘留； 方法優(yōu)化

諾氟沙星(NOR)、恩諾沙星(ENR)、環(huán)丙沙星(CIP)、達(dá)氟沙星(DAN)和沙拉沙星(SAR)為常見的氟喹諾酮類抗菌劑，目前在畜禽生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用.此類藥物使用不當(dāng)導(dǎo)致的藥物殘留可能直接危害人體健康，也可能使致病菌產(chǎn)生耐藥性，間接對(duì)人類健康造成影響[1- 2].多個(gè)國家和地區(qū)均規(guī)定了氟喹諾酮類藥物的最高殘留限量[1].檢測(cè)動(dòng)物源食品中氟喹諾酮類藥物殘留的方法有微生物法[3]、酶聯(lián)免疫法(ELISA)[4]、毛細(xì)管區(qū)帶電泳法[5- 6]、電解分析法[7]、高效液相色譜法(HPLC)[8-10]、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS)[11-14]等.目前，在雞肉產(chǎn)品的檢測(cè)中，常采用的方法是《動(dòng)物性食品中氟喹諾酮類藥物殘留檢測(cè)-高效液相色譜法》(農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告14- 2008)[15].本試驗(yàn)以此標(biāo)準(zhǔn)為基礎(chǔ)，簡(jiǎn)化了試驗(yàn)前處理方法，優(yōu)化了檢測(cè)過程.經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，該法非常適合大批量處理樣品，大量節(jié)省了處理時(shí)間和所需耗材，較大幅度降低成本，方法的靈敏度和回收率均可滿足我國現(xiàn)行獸藥殘留檢測(cè)分析的要求.

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

恩諾沙星對(duì)照品、環(huán)丙沙星對(duì)照品、諾氟沙星對(duì)照品、達(dá)氟沙星對(duì)照品、沙拉沙星對(duì)照品，均為中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所產(chǎn)品，磷酸二氫鉀、磷酸、三乙胺、氫氧化鈉溶液(分析純，廣州試劑廠)，乙腈(色譜純，F(xiàn)isher公司).

1.2 儀器和設(shè)備

Agilent高效液相色譜儀(美國Agilent公司)配熒光檢測(cè)器，高速勻質(zhì)機(jī)及振蕩器(德國IKA公司)，高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(美國Thermo公司).

1.3 試液配制

分別稱取恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星對(duì)照品各10 mg，置于同一個(gè)10 mL容量瓶中，用0.05 mol·L-1的氫氧化鈉溶液溶解定容至刻度，制得質(zhì)量濃度均為1 mg·mL-1的混合儲(chǔ)備溶液.準(zhǔn)確稱取達(dá)氟沙星對(duì)照品10 mg，0.05 mol·L-1的氫氧化鈉溶液溶解定容至10 mL，使其質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1.準(zhǔn)確稱取沙拉沙星對(duì)照品10 mg，0.05 mol·L-1的氫氧化鈉溶液溶解定容至10 mL，使其質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1.置2～8 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?，有效?個(gè)月.

取上述恩諾沙星、環(huán)丙沙星和諾氟沙星的混和儲(chǔ)備液100 μL，達(dá)氟沙星儲(chǔ)備液20 μL，沙拉沙星儲(chǔ)備液200 μL，置于同一個(gè)100 mL容量瓶中，用流動(dòng)相定容至刻度，配置成恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星的質(zhì)量濃度為1 μg·mL-1，達(dá)氟沙星質(zhì)量濃度為0.2 μg·mL-1，沙拉沙星質(zhì)量濃度為2 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液.

提取液：稱取2 g三氯乙酸于容量瓶中，加水至100 mL，制得的三氯乙酸溶液與乙腈按體積比3∶1的比例混合，攪拌均勻，得到提取液.

磷酸/三乙胺溶液：取磷酸3.4 mL，用水稀釋至1 000 mL，配成0.02 mol·L-1的磷酸溶液，用三乙胺調(diào)pH至2.4.臨用配制(易產(chǎn)生沉淀).

1.4 測(cè)定方法

1.4.1 供試材料的制備 將市售的雞肉樣品用高速勻漿機(jī)絞碎得到供試試料，將空白雞肉樣品絞碎得到空白試料，在空白試料中添加適宜濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液作為空白添加試料.

1.4.2 提取與凈化 稱取1 g試料，置于勻漿杯中，加提取液4 mL，高速勻漿1 min.勻漿液轉(zhuǎn)入15 mL聚丙烯離心管中，振蕩30 min，16 000 r/min，離心8 min，取上清液過0.2 μm濾膜，裝入進(jìn)樣瓶，待測(cè).

1.4.3 色譜條件 色譜柱：Agilent TC-C18250 mm×4.6 mm(i.d)，粒徑5 μm.流動(dòng)相：V(0.02 mol ·L-1磷酸/三乙胺溶液)∶V(乙腈)=80∶20.流速：1 mL·min-1.檢測(cè)波長：激發(fā)波長280 nm ；發(fā)射波長450 nm.進(jìn)樣量：20 μL.

1.5 線性范圍與檢出限

空白樣品中加入混合標(biāo)準(zhǔn)液配制成的諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、達(dá)氟沙星、沙拉沙星系列標(biāo)準(zhǔn)溶液.高效液相色譜儀檢測(cè)后，以峰面積為縱坐標(biāo)，藥物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析.在空白樣品中添加不同質(zhì)量濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“1.4”的方法進(jìn)行處理，檢測(cè)后取信噪比S/N=3對(duì)應(yīng)的樣品濃度為方法檢出限(LOD),信噪比S/N=10對(duì)應(yīng)的樣品濃度為方法定量限(LOQ).

1.6 回收率和精密度

向空白待測(cè)樣品中分別添加3個(gè)濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)液，按“1.4”的方法進(jìn)行處理，每個(gè)濃度重復(fù)5次，連續(xù)做3個(gè)批次，計(jì)算回收率和變異系數(shù).

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜分析

在試驗(yàn)選定的條件下，測(cè)得諾氟沙星的保留時(shí)間為6.67 min，環(huán)丙沙星為7.19 min，達(dá)氟沙星為8.18 min，恩諾沙星為9.07 min，沙拉沙星為12.93 min，峰形尖銳，分離完全，空白組織樣品在上述保留時(shí)間無干擾峰出現(xiàn)(圖1).

2.2 方法的檢出限及標(biāo)準(zhǔn)曲線

空白雞肉樣品中添加不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液 ，諾氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星的殘留定量限為10 μg·kg-1，達(dá)氟沙星的殘留定量限為2 μg·kg-1，沙拉沙星的殘留定量限為20 μg·kg-1.諾氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星的線性范圍為10～100 μg·kg-1，達(dá)氟沙星為2～20 μg·kg-1，沙拉沙星為20～200 μg·kg-1.對(duì)質(zhì)量濃度不同的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液進(jìn)行色譜分析，工作曲線的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)見表1.可見，本方法靈敏度高、線性范圍較寬，有一定的實(shí)用價(jià)值.

2.3 方法的回收率與精密度

對(duì)雞肉樣品分別進(jìn)行4個(gè)濃度的添加試驗(yàn)，測(cè)得的回收率為84.71%～99.66%，批內(nèi)變異系數(shù)為0.20%～4.42%，批間變異系數(shù)為0.33%～2.68%(表2).

1：諾氟沙星(0.1 μg·mL-1)；2：環(huán)丙沙星(0.1 μg·mL-1)；3：達(dá)氟沙星(0.02 μg·mL-1)；4：恩諾沙星(0.1 μg·mL-1)；5：沙拉沙星(0.2 μg·mL-1).

圖1 標(biāo)準(zhǔn)溶液(a)、空白肌肉添加藥品(b)、空白肌肉樣品(c)的色譜圖
Fig.1 The chromatography of standard solution of five fluoroquinolones(a),spiked sample(b),blank muscle tissue(c)

表1 方法的線性范圍、回歸方程與相關(guān)系數(shù)Tab.1 The linear ranges, regression equations and correlation coefficients

表2 回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Tab.2 Recoveries and relative standard deviations

2.4 抽樣檢測(cè)

從市場(chǎng)上購買30個(gè)雞肉樣品，每份樣品2個(gè)重復(fù)，按本方法進(jìn)行制樣和檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一例雞肉樣品中諾氟沙星殘留量為43.5 μg·kg-1，平行樣品中諾氟沙星的質(zhì)量濃度為41.4 μg·kg-1，其余樣品均未檢出氟喹諾酮藥物的殘留.表明該方法檢測(cè)雞肉中氟喹諾酮類藥物殘留量的重現(xiàn)性非常好，相對(duì)偏差保持在3%之內(nèi)，數(shù)據(jù)可靠.

3 討論與結(jié)論

3.1 樣品前處理方法的優(yōu)化

動(dòng)物源食品中基質(zhì)干擾復(fù)雜，富含脂肪和蛋白質(zhì)，選擇并優(yōu)化樣品的前處理方法對(duì)結(jié)果的準(zhǔn)確性尤為重要.本試驗(yàn)在農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告-14- 2008所采用方法[15]的基礎(chǔ)上，對(duì)樣品的前處理過程進(jìn)行了一定的優(yōu)化.該標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法采用磷酸鹽緩沖液提取完后，離心取上清液，過固相萃取柱，從而除去樣品中的雜質(zhì).本試驗(yàn)的提取液由乙腈與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的三氯乙酸按體積比1∶3混合而配得，蛋白質(zhì)在酸性條件下變性，離心出沉淀除掉雜質(zhì)，而提取液中加入乙腈也與流動(dòng)相中乙腈比例吻合，出峰較好.

比較其他相關(guān)研究，仲鋒[16]在雞組織中檢測(cè)氟喹諾酮類藥物殘留量的回收率為70%～107%，變異系數(shù)小于10%；陳紅等[17]在雞排泄物中檢測(cè)氟喹諾酮類藥物的回收率為75%以上，批內(nèi)變異系數(shù)在2.2%～10%之間，批間變異系數(shù)在6.2%～13.0%之間；而本試驗(yàn)測(cè)得的回收率為84.71%～99.66%，批內(nèi)變異系數(shù)為0.20%～4.42%，批間變異系數(shù)為0.33%～2.68%.相較而言，本試驗(yàn)的回收率有了明顯穩(wěn)定的提高，精密度和準(zhǔn)確度也相應(yīng)改善了，定量限能滿足日常采集樣品的檢測(cè)范圍，而且檢測(cè)的效率大大增加，節(jié)省了柱子的成本，減少了處理的時(shí)間，非常適用于樣本量較大時(shí)的殘留檢測(cè).

3.2 檢測(cè)方法的穩(wěn)定性

將新鮮配制的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液50 μg·kg-1于4 ℃冰箱中避光保存1、3、5、7 d后上機(jī)檢測(cè)，結(jié)果表明，被測(cè)藥物保留時(shí)間基本不變，但濃度明顯降低，可見標(biāo)液在保存過程中不穩(wěn)定，因此在測(cè)定過程中應(yīng)該做到現(xiàn)用現(xiàn)配，處理完后的樣品也應(yīng)及時(shí)上機(jī).

3.3 結(jié)論

本試驗(yàn)在農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告-14- 2008所采用方法[15]的基礎(chǔ)上，對(duì)樣品的前處理過程進(jìn)行了優(yōu)化，使樣品處理快捷便利，靈敏度高，重現(xiàn)性好，明顯降低批量樣品的檢測(cè)成本，可有效應(yīng)用于雞肉食品品質(zhì)的日常監(jiān)控.

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【責(zé)任編輯柴 焰】

Anoptimizationstudyondeterminationoffluoroquinolonesresiduesinchickenmusclebyhighperformanceliquidchromatography

LI Weicheng, JI Changyun, ZHANG Jingjie, CHENG Hankui, DENG Chao, ZHONG Jialian, DENG Xianbai, SHEN Xiangguang

(College of Veterinary Medicine, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

【Objective】 A method for rapid determination of five fluoroquinolones (norfloxacin，ciprofloxacin，danofloxacin，enrofloxacin，sarafloxacin) residues in chicken muscle using high performance liquid chromatography (HPLC) was established． 【Method】 The extracting solution of the chicken samples included a mixture of acetonitrile and trichloroacetic acid(the mass fraction of 2%). HPLC mobile phase consisted of acetonitrile and phosphate buffer (0.02 mol·L-1) with triethy lamine. Fluorometric excitation wavelength was 280 nm, and emission wavelength was 450 nm. 【Result and conclusion】 The recoveries of 5 fluoroquinolones were 84.71%-99.66% at three spiked level(low, medium, high), and the relative standard deviations (RSD) were 0.20%-4.34%.The limit of quantiation (LOQ) of norfloxacin, ciprofloxacin and enrofloxacin was 10 μg·kg-1. The LOQ of danofloxacin was 2 μg·kg-1，and the sarafloxacin was 20 μg·kg-1. The method is simple, practical, and sensitive. It can meet the needs of determination of fluoroquinolones in chicken muscle.

high performance liquid chromatography; fluoroquinolones; chicken muscle; residue; optimization

2013- 02- 21優(yōu)先出版時(shí)間2014- 07- 17

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http:∥www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.S.20140717.0910.030.html

李維鋮(1987—)，男，碩士研究生，E-mail：610659219@qq.com；通信作者：沈祥廣(1970—)，男，高級(jí)獸醫(yī)師，E-mail：shenxg@scau.edu.cn

省部產(chǎn)學(xué)研結(jié)合項(xiàng)目(2011B090400228)

李維鋮，姬長云，張靜潔 ，等.高效液相色譜法檢測(cè)雞肉中氟喹諾酮類藥物殘留量前處理方法的優(yōu)化[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2014,35(5):14- 18.

S859

A

1001- 411X(2014)05- 0014- 05