1個新的玉米半透明皺縮胚乳突變體的遺傳分析及基因定位

崔喜艷，胡廣宇，孫小杰，佟珊珊，陳眾峰，劉相國

(1 吉林農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院，吉林 長春 130118； 2 吉林省農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)業(yè)生物技術研究所，吉林 長春 130124； 3 吉林省中玉農(nóng)業(yè)有限公司，吉林 長春130012)

1個新的玉米半透明皺縮胚乳突變體的遺傳分析及基因定位

崔喜艷1，2，胡廣宇1，孫小杰3，佟珊珊1，陳眾峰1，劉相國2

(1 吉林農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院，吉林 長春 130118； 2 吉林省農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)業(yè)生物技術研究所，吉林 長春 130124； 3 吉林省中玉農(nóng)業(yè)有限公司，吉林 長春130012)

【目的】 解析半透明皺縮玉米胚乳形成機制.【方法】以純合玉米突變體M-E- 479為供試材料，通過對M-E- 479籽粒進行表型鑒定、遺傳分析、主要成分測定及掃描電鏡觀察，構建定位群體，利用圖位克隆技術對突變基因進行遺傳定位.【結(jié)果和結(jié)論】M-E- 479突變體胚乳中脂肪含量增加，蛋白質(zhì)和淀粉含量下降，淀粉粒的大小、形狀、排列空間發(fā)生改變；用F2群體將突變基因定位在10號染色體SSR標記bnlg1074與umc1506之間，兩標記的遺傳距離約為3.6 cM，兩標記的物理距離約為2.2 Mb.可見M-E- 479是一個新的玉米半透明皺縮胚乳突變體，突變性狀是由隱性單基因控制.

玉米； 胚乳突變體； 遺傳分析； 基因定位

玉米是重要的糧食作物，也是飼料、工業(yè)、化工、醫(yī)藥等的重要原料，在世界經(jīng)濟作物發(fā)展中也占據(jù)舉足輕重的地位[1].玉米的價值主要體現(xiàn)在籽粒上，籽粒中胚乳部分占籽粒干質(zhì)量的70%～90%[2].玉米胚乳分為角質(zhì)和粉質(zhì)2種類型，角質(zhì)胚乳中淀粉粒小、結(jié)構致密，較硬,半透明，富含蛋白質(zhì)；粉質(zhì)胚乳中淀粉粒大、結(jié)構松散，較軟,不透明，蛋白質(zhì)含量比較少.玉米胚乳性狀突變在突變體研究中較為常見，目前發(fā)現(xiàn)的胚乳突變體表型主要包括：皺縮、不透明、透明、凹陷、不育等多種[3- 6].隨著玉米基因組學研究的不斷深入，利用自然突變體或者人工突變體材料研究基因生物學功能，已成為功能基因組學研究的熱點領域，越來越多的玉米胚乳突變體相繼報道[7-10].

本課題組前期研究中，從自主構建的玉米自交系Mo17石蠟油-花粉-EMS誘變庫中篩選得到1個胚乳突變體，編號為479.該突變體具有半透明、皺縮等性狀(待發(fā)表).本研究以突變體479為試驗材料，開展玉米籽粒的形態(tài)特征、遺傳特性、主要成分、突變基因定位等方面研究工作，期望能夠明確該突變基因的基因定位和可能的生物學功能，為進一步克隆突變基因及解析半透明皺縮玉米胚乳形成機制提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試材料

親本1：玉米突變體(編號479)，用甲基磺酸乙酯(EMS)的石蠟油溶液處理玉米自交系品種Mo17的成熟花粉自交后，篩選獲得.該材料經(jīng)過3代的遺傳，鑒定為純合突變體，命名為M-E- 479(Mo17-EMS-編號479).親本2：玉米自交系Mo17(野生型).親本3：玉米自交系B73(野生型).以上玉米材料均由吉林省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)生物技術研究所提供.

1.2 構建定位群體和遺傳分析

于2010年夏季吉林省公主嶺市試驗田，玉米自交系Mo17、B73作為母本，M-E- 479作為父本，組配F1雜交種.同年冬季海南加代，F(xiàn)1代果穗套袋自交，獲得BC1和F2群體.BC1和F2群體用于遺傳分析，F(xiàn)2分離群體用于基因定位.

根據(jù)表型觀察結(jié)果，將BC1和F2群體中籽粒分為突變籽粒和正常籽粒2類.統(tǒng)計籽粒個數(shù)，利用2測驗進行遺傳分析.

1.3 玉米籽粒主要成分測定

粗蛋白(干基)[11]、粗脂肪(干基)[12]、粗淀粉(干基)[13]、直鏈淀粉(占淀粉質(zhì)量)和支鏈淀粉(占淀粉質(zhì)量)[14]按國家標準或農(nóng)業(yè)部標準方法測定.

以上玉米籽粒主要成分由農(nóng)業(yè)部參茸產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(吉林省)測定.

1.4 胚乳的掃描電鏡觀察

M-E- 479和對照組自交系Mo17的成熟胚乳干燥后縱切，雙面膠將胚乳樣品固定于檢測銅臺上，置于離子濺射儀中鍍金膜，制備觀察樣本.HITACHI S-570型掃描電子顯微鏡進行胚乳內(nèi)部結(jié)構觀察.

1.5 玉米基因組DNA提取

在溫室中種植F2群體突變籽粒和正常籽粒、親本2、親本3.三葉期剪取葉片，提取葉片基因組DNA用于基因定位分析.DNA 的提取采用CTAB法[15]，略作修改：即在用氯仿/異戊醇抽提后直接加入冷的異丙醇以沉淀DNA.

1.6 突變基因的BSA分析和定位

根據(jù)玉米數(shù)據(jù)庫(http:∥www.maizegdb.org.ssr/)公布信息，設計分子標記SSR引物用于基因定位.引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成.

BSA分析(Bulked segregation analysis)法也稱集團分離分析法，該方法根據(jù)目標基因表型差異，構建2個相對性狀的“基因池”，若在2類“基因池”中分子標記表現(xiàn)出多態(tài)性，說明該分子標記在遺傳上與目標性狀基因相連鎖.

PCR總反應體系為20 μL，包括10×Buffer(Mg2+Plus)1 μL，dNTP(10 mmol·L-1) 0.4 μL，上游引物和下游引物(10 μmol·L-1)各0.25 μL，TaqDNA Polymerase(5 U·L-1)0.2 μL，ddH2O 5.9 μL，DNA模板(50 ng·μL-1)12 μL.在BioRad PCR儀上進行PCR擴增，PCR反應條件:94 ℃預變性 5 min;94 ℃變性 45 s，58 ℃退火 45 s，72 ℃延伸1 min，共進行 36個循環(huán)；72 ℃再延伸 10 min.反應產(chǎn)物在80 g·L-1的聚丙烯酰胺凝膠上電泳，經(jīng)質(zhì)量分數(shù)為0.2%硝酸銀染色后觀測并成像分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 M-E- 479表型分析

如圖1所示，M-E- 479籽粒表面種皮皺縮，頂端質(zhì)地透明(圖1a)，自交系Mo17的籽粒飽滿(圖1b)；M-E- 479的胚乳縱切(圖1c)與Mo17(圖1d)相比，表現(xiàn)為體積變小，種皮皺縮，角質(zhì)化明顯，質(zhì)地透明，頂端粉質(zhì)部分嚴重缺失.

a: M-E- 479的籽粒；b: 自交系Mo17的籽粒；c: M-E- 479的胚乳(縱切)；d: 自交系Mo17的胚乳(縱切).

2.2 M-E- 479遺傳分析

利用自交系Mo17、自交系B73與M-E- 479構建BC1、F2分離群體，各獲得30個具有突變籽粒的果穗，統(tǒng)計正常籽粒與突變籽粒的數(shù)目，計算分離比(表1).2測驗結(jié)果表明即正常籽粒與突變籽粒之比符合3∶1的孟德爾遺傳規(guī)律分離比例，證實M-E- 479的性狀是由隱性單基因控制的.

表1 BC1和F2群體性狀分離結(jié)果

2.3 M-E- 479籽粒主要成分測定

從表2中可以看出，與對照組Mo17相比，突變體M-E- 479的蛋白質(zhì)和淀粉含量均呈現(xiàn)下降趨勢，分別減少5.96%和9.89%.其中，淀粉含量的減少主要體現(xiàn)在支鏈淀粉含量的劇烈下降，減少11.63%，而直鏈淀粉含量增加1.74%.突變體的粗脂肪含量較對照組呈現(xiàn)上升趨勢，增加1.82%.結(jié)果表明，該突變基因與玉米胚乳中脂肪、蛋白質(zhì)及淀粉等儲藏物質(zhì)合成代謝相關.

表2自交系Mo17和M-E- 479胚乳主要成分占干質(zhì)量比例

Tab.2ThepercentageoftheendospermmainingredientsofMo17andM-E- 479 (drymass) %

品種蛋白質(zhì)粗脂肪淀粉直鏈淀粉支鏈淀粉Mo1717.144.2478.9615.9962.97M-E-47911.186.0669.0717.7351.34

2.4 M-E- 479胚乳掃描電鏡觀察

對M-E- 479和自交系Mo17的成熟胚乳進行掃描電鏡觀察，結(jié)果表明：自交系Mo17角質(zhì)胚乳細胞被大量淀粉粒充實，呈較規(guī)則的長多面體排列；M-E- 479角質(zhì)胚乳細胞則呈圓形、橢圓形、多邊形等不規(guī)則排列(圖2b、2f).粉質(zhì)部分300倍和2 000倍的放大圖片顯示：M-E- 479中胚乳細胞排列無規(guī)則，且大小不均一(圖2c)，淀粉粒排列緊密，積壓呈多面體狀，表面附著大量基質(zhì)蛋白(圖2d)；Mo17中胚乳細胞規(guī)則，呈圓形，大小均一(圖2g)，淀粉粒排列松散，表面較光滑，附著少量基質(zhì)蛋白(圖2h)；從M-E- 479和自交系Mo17胚乳結(jié)構比較來看，突變基因能夠?qū)е屡呷橹械矸哿５拇笮　⑿螤?、排列空間發(fā)生改變.

2.5 M-E- 479突變基因的BSA分析及定位

從玉米數(shù)據(jù)庫中選擇均勻覆蓋玉米基因組的350對SSR標記，對親本進行多態(tài)性的篩選，篩選到有多態(tài)性的引物112對.在F2代中分別選取10株正常籽粒和10株突變籽粒構建正?；虺睾屯蛔兓虺?利用這112對SSR引物對構建好的正?；虺睾屯蛔兓虺剡M行擴增.結(jié)果發(fā)現(xiàn)位于10號染色體上的SSR分子標記umc1789在2個池中表現(xiàn)出多態(tài)性(圖3中的17、18泳道)，表明M-E- 479的突變基因位于10號染色體長臂上，在umc1789附近.

為了進一步界定突變基因的位點，在SSR標記umc1789的上游、下游設計新的引物，對513份F2代突變個體進行分析.研究結(jié)果表明：M-E- 479的突變基因定位于SSR分子標記bnlg1074與umc1506之間.在513份個體中，對于bnlg1074共篩選到6個交換單株，對于umc1506共篩選到12個交換單株，根據(jù)遺傳距離的計算方法，bnlg1074與突變基因的遺傳距離是1.2 cM，umc1506與突變基因的遺傳距離是2.3 cM(圖4)，兩個SSR標記之間的物理距離約2.2 Mb.

a～d為M-E- 479, e～h為Mo17.其中,a、e:為胚乳整體圖(25×);b、f:為胚乳角質(zhì)圖(300×); c、g:為胚乳粉質(zhì)圖(300×); d、h:為胚乳粉質(zhì)圖(2 000×).

圖2 M-E-479與自交系Mo17胚乳的掃描電鏡圖片
Fig.2 The scanning electron microscopy of M-E- 479 endosperm and Mo17endosperm

奇數(shù)泳道為正常個體的基因池，偶數(shù)泳道為突變個體的基因池.

圖4 M-E- 479突變基因的遺傳圖譜Fig.4 The genetic map of M-E- 479 mutant genes

3 討論

在眾多玉米突變體研究中，粉質(zhì)型胚乳突變體研究最為深入.粉質(zhì)型胚乳突變體即opaque突變體，主要表現(xiàn)不透明的且硬質(zhì)淀粉部分缺失.1935年Emerson等[16]首次發(fā)現(xiàn)玉米o2(opaque2)突變.1964年美國普渡(Purdue)大學Mertz等[17]發(fā)現(xiàn)隱性突變基因o2能夠抑制胚乳玉米醇溶蛋白合成，提高胚乳中賴氨酸含量.1971年McWhirter[18]發(fā)現(xiàn)一個玉米高賴氨酸粉質(zhì)胚乳突變體，命名為o7(opaque7)突變體，該突變基因位于玉米第10號染色體.2005年Yang等[19]從Robertson增變子Mu(Mutator)突變?nèi)后w中，分離得到一個胚乳質(zhì)地不透明、高賴氨酸突變自交系，命名為o16(opaque16)，定位于第8號染色體長臂上umc1141和umc1121 這2個分子標記之間，遺傳距離約為5 cM.除了粉質(zhì)型胚乳突變體之外，透明/半透明玉米胚乳突變體的研究也備受關注.該類型突變體主要表現(xiàn)為粉質(zhì)淀粉部分缺失.目前，關于該類突變體的研究主要有su1(sugary1)突變體和ae1(amyloseextender1)突變體2種.1911年East等[20]首先描述su1突變體，突變基因在乳熟期能阻止糖分向淀粉轉(zhuǎn)化，使還原糖、蔗糖含量顯著高于普通玉米，使玉米未成熟籽粒中大量累積水溶性多糖，成熟時籽粒皺縮且透明.1952年Vineyard等[21]首次記述ae1突變體，它是由編碼淀粉分支酶SBEIIb的基因突變形成的.該突變基因降低了支鏈淀粉的α-1,6糖苷鍵分支點的數(shù)量而相應地增加了籽粒表觀直鏈淀粉含量.大量玉米突變體的發(fā)現(xiàn)及突變基因的分離可為特異玉米品種的創(chuàng)制提供種質(zhì)資源及候選基因.

隨著玉米自交系Mo17和B73全基因組序列測序的完成[22]，以及玉米高密度遺傳圖譜和物理圖譜相繼構建成功[23]，圖位克隆技術在玉米功能基因研究領域中開始廣泛應用.2011年Wang等[24]和孫大元等[25]利用圖位克隆技術對突變基因o7進行了深入分析，克隆該基因全序列，分析表明，其編碼一個草酰輔酶a合成酶，參與儲藏蛋白質(zhì)的合成代謝.

本研究利用圖位克隆技術將M-E- 479的突變基因定位于10號染色體上Bin10.04處，根據(jù)玉米數(shù)據(jù)庫公布信息發(fā)現(xiàn)，在10號染色體上有2個關于胚乳突變的突變體:o7(opaque7)和du1(dull1)[22]，但o7和du1突變基因位點分別在10號染色體上Bin10.03和Bin10.07處，與M-E- 479的突變基因位點不同；o7和du1籽粒表現(xiàn)型為不透明且飽滿，M-E- 479籽粒表現(xiàn)型為半透明且皺縮，從表型上來看,M-E- 479不是o7或du1的這類胚乳突變體.此外，M-E- 479的突變基因定位在SSR分子標記bnlg1074與umc1506之間，查閱文獻可知兩標記之間已經(jīng)公布了4個玉米基因wsm3、AY110167、IDP2392和TIDP2822，其中基因wsm3導致玉米葉片出現(xiàn)黃綠斑,其余3個基因只是被克隆了全序列，鮮見基因功能驗證的報道[24- 28].本研究中基因定位區(qū)段還未發(fā)現(xiàn)與玉米胚乳發(fā)育和形成相關基因克隆的報道.綜上所述，本研究鑒定M-E- 479是一個新的玉米半透明皺縮胚乳突變體.

掃描電鏡觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該基因突變導致胚乳中淀粉粒的形態(tài)和空間排列發(fā)生顯著改變，M-E- 479突變基因可能是通過影響胚乳中淀粉粒的形成來調(diào)控玉米淀粉合成代謝.從玉米籽粒物質(zhì)含量測定數(shù)據(jù)可以看出，突變體胚乳中蛋白質(zhì)和淀粉含量顯著下降，脂肪含量卻明顯增加.由此推測該突變基因不僅參與淀粉合成代謝，還可能參與調(diào)控玉米胚乳中脂肪、蛋白質(zhì)及淀粉等儲藏物質(zhì)間的協(xié)同轉(zhuǎn)換.

本研究將玉米胚乳突變基因定位在10號染色體上SSR分子標記bnlg1074與umc1506之間，在兩標記之間尚無公布的對于定位群體具有多態(tài)性的SSR引物.雖然我們已經(jīng)開發(fā)與該突變基因緊密連鎖的新的SSR分子標記，但由于篩選到的交換單株較少，目前還無法進行M-E- 479突變基因的精細定位.未來的研究中，我們會加大定位群體數(shù)量，篩選更多的交換單株，完成突變基因定位、克隆和功能解析等研究工作.這些研究的順利進行對于未來解析半透明皺縮玉米胚乳形成機制具有重要意義.

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【責任編輯李曉卉】

Ageneticanalysisandgenemappingofanewtranslucentandshrunkenendospermmutantinmaize

CUI Xiyan1,2, HU Guangyu1, SUN Xiaojie3, TONG Shanshan1,CHEN Zhongfeng1, LIU Xiangguo2

(1 College of Life Sciences, Jilin Agricultural University, Changchun 130118，China; 2 Institute of Agricultural Biotechnology in Jilin Academy of Agricultural Sciences, Changchun 130124, China; 3 Jilin Sino-Corn Agricultural Co., Ltd., Changchun 130012, China)

【Objective】 To analyze the formation mechanism of translucent and shrunken maize endosperm. 【Method】 The mutant M-E- 479 of homozygous maize was used as experimental materials in our study. Through phenotypic identification, genetic analysis, main ingredients measurement and scanning electron microscopy, mapping population of M-E- 479 was selected and map-based cloning technology was performed to locate the mutant gene.【Result and conclusion】 The result showed that the amount of fat increased, while the protein and starch decreased, and the starch grains changed in size, shape and space configuration in the mutant endosperm of M-E- 479. The mutant gene is located between SSR markers bnlg1074 and umc1506 of chromosome 10 by using F2 population. Meanwhile, the genetic distance is about 3.6 cM and the physical distance is about 2.2 Mb. The results suggest that M-E- 479 is a new translucent and shrunken maize endosperm mutant, and its mutant character may be controlled by a recessive single gene.

maize; endosperm mutant; genetic analysis; gene mapping

2013- 09- 21優(yōu)先出版時間2014- 07- 17

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http:∥www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.S.20140717.0909.027.html

崔喜艷(1971—)，女，副教授，博士，E-mail: cuixiyan2005@163.com; 通信作者:劉相國(1983—)男，助理研究員，博士，E-mail:lxgyyj@foxmail.com

國家自然科學基金(31170731，31200611)；上海市科學技術委員會資助項目(10DZ2271800)；吉林省科技發(fā)展計劃項目(20130206012NY)

崔喜艷，胡廣宇，孫小杰，等.1個新的玉米半透明皺縮胚乳突變體的遺傳分析及基因定位[J].華南農(nóng)業(yè)大學學報，2014,35(5):31- 35.

S513.035.2

A

1001- 411X(2014)05- 0031- 05