洛克沙胂暴露對土壤微生物碳代謝功能多樣性的影響

張 草, 白 玲, 郭瑞子, 馬 驛, 孫永學

(1 華南農(nóng)業(yè)大學, 國家獸藥安全評價(環(huán)境評估)實驗室，廣東 廣州 510642；2 廣東海洋大學 動物醫(yī)學系，廣東 湛江 524088)

洛克沙胂暴露對土壤微生物碳代謝功能多樣性的影響

張 草1, 白 玲1, 郭瑞子1, 馬 驛2, 孫永學1

(1 華南農(nóng)業(yè)大學, 國家獸藥安全評價(環(huán)境評估)實驗室，廣東 廣州 510642；2 廣東海洋大學 動物醫(yī)學系，廣東 湛江 524088)

【目的】運用Biolog法分析洛克沙胂作用下的土壤微生物群落碳代謝多樣性，以揭示洛克沙胂在環(huán)境中殘留對土壤微生物學性狀的影響.【方法】采集新鮮土壤加入不同質(zhì)量濃度的洛克沙胂溶液混勻，使藥物質(zhì)量分數(shù)(以As計)分別為：低質(zhì)量分數(shù)組15 mg·kg-1、中質(zhì)量分數(shù)組75 mg·kg-1、高質(zhì)量分數(shù)組150 mg·kg-1，放置在室溫(20～25 ℃)下培養(yǎng)，于處理后第1、2、3、5、8周分別采取培養(yǎng)土壤,用Biolog法進行分析.【結(jié)果和討論】洛克沙胂對土壤微生物群落碳代謝功能影響顯著，且存在一定的劑量依賴效應.經(jīng)主成分分析，第1周，洛克沙胂低質(zhì)量分數(shù)組(w=15 mg·kg-1)土壤微生物群落多樣性和對照組差異不明顯，第2、3、5、8周，各組土壤微生物群落碳代謝類型差異顯著，其中高質(zhì)量分數(shù)組(w=150 mg·kg-1)與對照組差異最大.結(jié)果表明，洛克沙胂可致土壤微生物群落碳代謝能力與多樣性改變，脅迫濃度越高其作用越強.同時，洛克沙胂對土壤微生物群落碳代謝能力與多樣性的影響還表現(xiàn)出時間差異，在暴露脅迫的后期(第5、8周)，洛克沙胂的影響逐步減弱，可能與洛克沙胂在土壤中發(fā)生化學結(jié)構(gòu)改變和降解有關(guān).

洛克沙胂； 土壤微生物群落； 功能多樣性； 微生物碳源利用率

洛克沙胂(Roxarsone)是一種有機胂類化合物，作為畜禽專用抗菌、促生長的飼料添加劑已在我國得到廣泛使用，研究表明，畜禽攝入有機胂添加劑后在胃腸道吸收少、體內(nèi)蓄積時間很短、殘留量低，80%～90%以原形通過糞便排泄到體外.一個養(yǎng)殖規(guī)模為2億羽肉雞場，每年向環(huán)境排放8 t以上的砷[1].洛克沙胂污染土壤后使其質(zhì)量降低，農(nóng)作物產(chǎn)量減少，最終經(jīng)過土壤物質(zhì)循環(huán)降解可能轉(zhuǎn)化成無機砷形式而造成更嚴重的危害，對人類的健康形成了很大的潛在風險.

土壤是一個非常復雜的生態(tài)系統(tǒng)，土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，它在分解有機質(zhì)和循環(huán)利用養(yǎng)分的過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用[2-3].近年來以生物化學為基礎的測定方法(微生物醌法，脂肪酸法等)和分子生物學方法(PCR-RFLP，TGGE，DGGE 等)相繼得到了廣泛應用[4- 8]，其中，Biolog法已成為研究微生物功能多樣性的重要工具，它為土壤微生物群落研究提供了一種更為簡單、快速的方法[9-10]，而且無需分離培養(yǎng)純種微生物，并可最大限度地保留微生物群落原有的代謝特征.本試驗通過研究不同質(zhì)量濃度洛克沙胂對土壤微生物碳代謝功能的影響，揭示了洛克沙胂暴露脅迫對土壤微生物學性狀的影響，為評估和監(jiān)控洛克沙胂對土壤環(huán)境的早期污染和生態(tài)毒理學效應提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

洛克沙胂原料藥，質(zhì)量分數(shù)為98.5%，為廣州惠華動物保健品有限公司產(chǎn)品.土壤采自華南農(nóng)業(yè)大學試驗田20～100 cm 土層的勻質(zhì)土壤，質(zhì)細，色深，基本理化性狀為：有機碳(48.35±3.52) g·kg-1，總氮(2.38±0.19) g·kg-1，總磷(12.27±1.99) g·kg-1，總鉀(0.15±0.04) g·kg-1，pH(6.2±0.55).供試土壤未檢測出洛克沙胂殘留.

1.2 方法

1.2.1 土壤處理 新鮮土壤過4 mm篩后在室溫下放置3 d，分別倒入5 L的塑料桶中，每桶裝3 kg鮮土，按每3 kg鮮土加入50 mL不同質(zhì)量濃度的洛克沙胂溶液混勻，使藥物質(zhì)量分數(shù)(以As計)分別為：低質(zhì)量分數(shù)組15 mg·kg-1、中質(zhì)量分數(shù)組75 mg·kg-1、高質(zhì)量分數(shù)組150 mg·kg-1，每組設置3個平行.不添加洛克沙胂溶液的土壤為空白對照組.將土壤的含水量調(diào)至最大蓄水量的50%，且以濕布蓋在表面，放置在室溫(20～25 ℃)下培養(yǎng).培養(yǎng)期間損失的少量水分通過稱重法來補充.于處理后第1、2、3、5、8周分別采取培養(yǎng)土壤進行分析.

1.2.2 Biolog法 采集新鮮土壤10 g，加90 mL滅菌生理鹽水，210 r/min 25 ℃條件下振蕩培養(yǎng)30 min，吸取上清液做1 000倍稀釋，再吸取150 μL到Biolog EcoPlate 微平板孔內(nèi) 25 ℃培養(yǎng)，在590和760 nm下測定Eco板的每孔光密度值，采集數(shù)據(jù)進行分析.每隔12 h測1次，連續(xù)測10 d.

平均每孔顏色變化率(AWCD)計算[11-12]方法：AWCD =∑(D-D)/n，式中D為各有培養(yǎng)基孔的光密度值，D為對照孔的光密度值，n為培養(yǎng)基數(shù)值，EcoPlate板的n為31.

多樣性指數(shù)(Shannon-Wiener指數(shù))H=-∑PilnPi，Pi為減去空白之后每孔的光密度值,Pi=(D-D)/∑(D-D).

豐富度指數(shù)指被利用的碳源的總數(shù)目,為每32孔中D-D的值大于0.25的孔數(shù)[13].

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 采用 Microsoft Excel 2007 處理數(shù)據(jù)，SPSS 11.5 軟件進行統(tǒng)計分析和主成分分析，采用單因素方差分析檢驗不同處理之間的差異(LSD，α= 0.05).所有數(shù)據(jù)均為平均值±標準誤.

2 結(jié)果

2.1 土壤微生物對碳源的利用強度

由圖1可知，洛克沙胂含量不同，土壤微生物對碳源的利用強度不同，對照組的碳代謝強度明顯高于用藥組，在試驗早期(第1周)，碳代謝強度隨著洛克沙胂質(zhì)量分數(shù)的增加而出現(xiàn)明顯降低(P<0.05)；第3周和5周，高、中質(zhì)量分數(shù)組之間差異不顯著，低質(zhì)量分數(shù)組的碳代謝強度則高于高、中質(zhì)量分數(shù)組；第8周，藥物處理組的碳代謝強度升高.

同一培養(yǎng)時間數(shù)據(jù)柱上，凡有一個相同字母者，表示差異不顯著(P>0.05).

圖1 不同質(zhì)量分數(shù)洛克沙胂處理下土壤微生物群落利用碳源的強度

Fig.1 Carbon metabolic intensity of soil microbial communities for each treatment

2.2 土壤微生物群落碳代謝多樣性

每孔顏色變化率是反映土壤微生物活性，即利用單一碳源能力的一個重要指標[14].圖2表明，隨著培養(yǎng)時間延長，顏色變化率逐漸升高，對照組的顏色變化率值顯著高于用藥組，且大小順序為：空白對照組>低質(zhì)量分數(shù)組>中質(zhì)量分數(shù)組>高質(zhì)量分數(shù)組.第1、2、3、5和8周，高質(zhì)量分數(shù)(150 mg·kg-1)組土壤的顏色變化率值顯著低于低質(zhì)量分數(shù)組(P<0.05)，較對照組降低了17.39%～54.69%；除了第1周外，其他時間采樣點的中、高質(zhì)量分數(shù)組之間的顏色變化率值差異均不顯著.

培養(yǎng)基Shannon-Wiener多樣性指數(shù)反映的是微生物對碳源類型的利用多少，豐富度指數(shù)是微生物利用碳源的數(shù)量，表1是土壤微生物群落代謝功能豐富度指數(shù)和多樣性指數(shù)與藥物濃度的變化情況，由表1可知，豐富度指數(shù)和多樣性指數(shù)均與藥物濃度和時間呈負相關(guān).隨著培養(yǎng)時間的延長，各組的多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)逐漸降低，對照組的多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)明顯高于用藥組，且空白對照組>低質(zhì)量分數(shù)組>中質(zhì)量分數(shù)組>高質(zhì)量分數(shù)組.在用藥后第1、2、3、5和8周時間點上，高質(zhì)量分數(shù)組(150 mg·kg-1)土壤多樣性指數(shù)與豐富度指數(shù)顯著低于低質(zhì)量分數(shù)組(P<0.05).

圖2 不同質(zhì)量分數(shù)洛克沙胂處理下不同時間土壤平均顏色變化率Fig.2 Average well colour development in soil under different treatments

表1 土壤微生物利用Biolog微平板碳源的豐富度指數(shù)和多樣性指數(shù)1)Tab.1 Richness indexes and diversity indexes of utilized substrates under each treatment

1) 同行同一指標數(shù)據(jù)后凡有一個相同小寫字母者，表示差異不顯著(P>0.05).

2.3 土壤微生物群落代謝功能主成分分析

將Biolog-Eco微平板的31個碳源的測定結(jié)果形成的描述微生物群落代謝特征的多元向量變換為互不相關(guān)的主元向量(PC1和PC2是主元向量的分量)，在降維后的主元向量空間中直接用點的位置直觀地反映出不同微生物群落的代謝特征.分析結(jié)果表明：土壤微生物群落的代謝多樣性類型有明顯差異.

PC1解釋了微生物群落碳代謝類型的分異程度 (圖3), 第1周PC1為27.19%，得分系數(shù)F3，8=17.432,P<0.05，呈差異顯著；第2周PC1為49.79%，得分系數(shù)F3,8=84.20,P<0.01，差異極顯著；第3周PC1為50.40%，得分系數(shù)F3,8= 67.92,P<0.01，差異極顯著；第5周PC1為45.82%，得分系數(shù)F3,8= 62.16,P<0.01，差異極顯著；第8周PC1為63.82%，得分系數(shù)F3,8=86.46,P<0.001，差異極顯著.由31個碳源的主成分分析可見，第1周，洛克沙胂低質(zhì)量分數(shù)組(w=15 mg·kg-1)土壤微生物群落代謝類型和對照組差異不明顯；第2、3、5周，各處理組的土壤微生物群落碳代謝類型差異明顯(P<0.05)，各采樣點的高質(zhì)量分數(shù)處理組(w=150 mg·kg-1)與對照的差異最大(群落碳代謝類型相差最遠)；培養(yǎng)后期(第5、8周)，中、高質(zhì)量分數(shù)處理組之間差異不顯著.

圖3 不同處理土壤微生物群落碳代謝類型主成分分析Fig.3 Principal component analyses of the carbon-source metabolic capacity of soil microbial communities under different treatments

3 討論

通常認為土壤微生物代謝功能多樣性是定量描述土壤環(huán)境微生物群落變化特征的重要指標之一.由美國Biolog公司開發(fā)的自動微生物鑒定系統(tǒng)是一種簡單、快速，以群落水平碳源利用類型為基礎的氧化還原技術(shù).近幾十年以來，研究者通過污染稻田土和模擬盆栽等試驗，對Cu、Zn、Pb、Cd、Cr、Hg、As等7種重金屬[15-17]對土壤微生物數(shù)量及群落結(jié)構(gòu)多樣性的影響方面進行了大量研究工作，Muhammad等[18]研究Pb、Cd污染對土壤中微生物多樣性的影響，結(jié)果表明高濃度的重金屬能顯著影響微生物的群落結(jié)構(gòu).Wang等[19]運用PCR-DGGE方法研究了Cu、Zn污染土壤中微生物的多樣性，結(jié)果表明，重金屬污染對土壤中微生物活性和群落組成產(chǎn)生了顯著影響.華建峰等[20]采用Biolog法研究了重金屬砷對土壤微生物群落多樣性的影響，結(jié)果表明，中濃度As和高濃度As土壤微生物對糖類、氨基酸類等碳源的利用程度顯著高于低濃度As土壤.洛克沙胂作為一種有機胂添加劑，它可降解為無機砷，對土壤微生物具有一定毒性作用，本試驗中洛克沙胂暴露處理土壤的結(jié)果與其他重金屬作用已有報道的結(jié)果相一致，土壤微生物的碳代謝功能多樣性隨用藥濃度的升高而降低.

我國土壤砷含量最高背景值一般認為是15 mg·kg-1，曾婧等[21]對我國7 省區(qū)共43個養(yǎng)殖場周邊環(huán)境土壤調(diào)查中顯示砷含量為12.7～56.0 mg·kg-1.本試驗以我國土壤砷含量最高背景值為低質(zhì)量分數(shù)，設立15、75和150 mg·kg-1為低中高3個質(zhì)量分數(shù).研究結(jié)果表明，洛克沙胂作用于土壤后第1、2、3、5、8周時土壤微生物群落代謝功能多樣性均受到影響，藥物質(zhì)量分數(shù)越高則土壤群落代謝功能性多樣性指數(shù)越低.在整個培養(yǎng)時間內(nèi)各用藥組顏色變化率值均低于對照組，說明在洛克沙胂作用下，土壤微生物利用碳源的能力降低，且隨藥物質(zhì)量分數(shù)的增加而降低.洛克沙胂本身具有殺菌和殺寄生蟲的作用，進入生態(tài)環(huán)境后最終會降解成可溶于水的無機砷類物質(zhì)，無機砷是毒性較大的重金屬.重金屬之所以對微生物有毒害作用，主要是因為重金屬大都不能被生物分解，極易在生物體內(nèi)積累，而且它們極易與一些生物大分子酶的活性中心和極性電子基團結(jié)合，導致這些生物大分子失活，最終引起微生物死亡.土壤微生物數(shù)量減少，碳代謝能力與強度降低，第1、2、3、5周，中、高質(zhì)量分數(shù)洛克沙胂處理組與對照組之間的差異顯著，表明洛克沙胂暴露脅迫質(zhì)量分數(shù)越高，對土壤的微生物生態(tài)毒性就越大.第8周，藥物處理組的碳代謝能力與強度升高，可能是由于土壤中藥物的有效作用質(zhì)量分數(shù)降低，一些對洛克沙胂耐受的微生物得到生長并逐漸成為優(yōu)勢菌群.

主成分分析明顯區(qū)分了不同質(zhì)量分數(shù)洛克沙胂影響下的土壤微生物群落碳代謝類型差異程度，具體表現(xiàn)在隨著污染程度的增加，其在主成分分布圖上向X軸的負方向延伸，洛克沙胂質(zhì)量分數(shù)越高則與對照組相距越遠；自第1周開始，低質(zhì)量分數(shù)組與對照組明顯分開；培養(yǎng)前中期，中、高質(zhì)量分數(shù)組與對照組各自明顯分開，說明中、高質(zhì)量分數(shù)洛克沙胂改變了土壤微生物碳代謝類型；后期(第5、8周)差異不顯著.土壤本身是非常復雜的系統(tǒng)，可能是藥物在土壤中隨著時間的推移發(fā)生遷移、轉(zhuǎn)化、吸附等有關(guān).

目前，研究重金屬對土壤微生物學性狀的影響大都是在實驗室受控條件下進行的，通常使用單因子變量來進行研究，但在自然環(huán)境中，往往有各種環(huán)境因素相互作用，因此要將實驗室得出的結(jié)論外推到自然條件下比較困難，而且室內(nèi)與野外試驗的結(jié)果也常有差異.另外，不同的微生物由于重金屬污染的長期與短期效應而表現(xiàn)出不同的敏感性.而室內(nèi)試驗由于是在可控條件下操作，仍可較明確反映單一因素的影響情況，因此，進一步研究洛克沙胂對土壤微生物的生態(tài)毒理還需結(jié)合野外的實地試驗結(jié)果來反應重金屬污染的生態(tài)效應.

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【責任編輯柴 焰】

Effectsofroxarsoneexpotocarbon-sourcemetaboliccapacityandfunctionaldiversityofsoilmicrobialcommunities

ZHANG Cao1, BAI Ling1, GUO Ruizi1, MA Yi2, SUN Yongxue1

(1 National Laboratory of Safety Evaluation (Environmental Assessment) of Veterinary Drugs, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China； 2 Department of Veterinary Medicine, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, China)

【Objective】 To evaluate the effects of roxarsone residues on the microbiological characteristics of soil, the carbon-source metabolic functions of the soil microbial communities exposed to roxarsone and studied by Biolog technology. 【Method】 Fresh soil with different concentrations of roxarsone solution mix were collected so that drugs were (as As): group 15 mg·kg-1, group 75 mg·kg-1, group 150 mg·kg-1, cultivated at room temperature (20-25 ℃). Soil samples were taken after 1,2,3,5,8 weeks of treatment for analysis using Biolog method. 【Result and conclusion】 The results showed that the carbon-source metabolic functions of the soil microbial communities of groups treated with roxarsone were significantly distinguished from that of CK, indicating a dose-dependent relationship. The carbon-source metabolic functional diversity of soil microbial communities in the lower roxarsone groups (w=15 mg·kg-1) were not significantly different from the control group during the 1st week. However, the soil microbial community functional diversity in the four groups (control, low, medium and high group) was significantly different in the 2nd, 3rd, 5th and 8th week. The difference between control and treatment groups appeared to be much more severe with the increase of roxarsone concentration. It is concluded that the carbon-source metabolic capacity and functional diversity of soil microorganisms in roxarsone treatment groups change with the increase of roxarsone concentration. In the 2nd week and 3rd week, the functional diversity of the soil microbial community of the three roxarsone groups decrease more rapidly compared with that in the 5th week and 8th week, which might be caused by the chemical conversion and degradation of roxarsone in soil.

roxarsone; soil microbial community; functional diversity; microbial utilization rate of carbon source

2013- 12- 05優(yōu)先出版時間2014- 07- 17

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http:∥www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.S.20140717.0910.031.html

張 草(1987—)，男，碩士研究生，E-mail:372985394@qq.com；通信作者：孫永學(1969—)，男，教授，博士，E-mail: sunyx@scau.edu.cn

國家自然科學基金 (31172368)；廣東省自然科學基金 (S2011010001090)

張 草, 白 玲, 郭瑞子，等.洛克沙胂暴露對土壤微生物碳代謝功能多樣性的影響[J].華南農(nóng)業(yè)大學學報，2014,35(5):8- 13.

S859

A

1001- 411X(2014)05- 0008- 06