轉(zhuǎn)基因作物中2種除草劑抗性基因 >aad1和dmo的PCR檢測(cè)方法

龍麗坤， 韓 月， 楊丹丹， 閆 偉， 李飛武*

1吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所，吉林 長(zhǎng)春130033； 2哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150025

除草劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上對(duì)田間雜草的防治具有十分重要的作用，根據(jù)其作用方式可分為選擇性除草劑和滅生性除草劑(陳海偉等，2012)。隨著除草劑抗性基因的發(fā)現(xiàn)并將其通過遺傳工程手段導(dǎo)入主要農(nóng)作物中，抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物取得了重大發(fā)展，是當(dāng)前應(yīng)用面積最廣的轉(zhuǎn)基因作物類型。2013年全球種植的抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物(包括抗蟲抗除草劑復(fù)合性狀)超過1.46億hm2，占轉(zhuǎn)基因作物種植總面積的83.6%，其中具有草甘膦抗性和草銨膦抗性的轉(zhuǎn)基因作物占絕大多數(shù)，這2類轉(zhuǎn)基因作物的應(yīng)用可確保在整個(gè)生長(zhǎng)季使用滅生性除草劑控制田間雜草而不會(huì)對(duì)作物造成傷害，有效降低了雜草的控制成本(James，2014)。近年來，一些新的除草劑抗性基因被相繼發(fā)掘和應(yīng)用到轉(zhuǎn)基因作物中，使得除草劑的使用更具靈活性。

轉(zhuǎn)基因技術(shù)的快速發(fā)展給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來諸多有利因素，但作為一項(xiàng)在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用不到20年的新興技術(shù)，社會(huì)公眾對(duì)其認(rèn)知度和接受程度還有待提高，圍繞轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品是否安全的討論在社會(huì)層面廣泛存在(劉培磊等，2011)。鑒于此，許多國(guó)家根據(jù)各自國(guó)情，制定了轉(zhuǎn)基因生物安全管理法律法規(guī)，其中50多個(gè)國(guó)家和地區(qū)建立了標(biāo)識(shí)制度，要求對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品實(shí)行定性或定量標(biāo)識(shí)，以滿足社會(huì)公眾的知情權(quán)和選擇權(quán)(王榮談等，2013)。而轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識(shí)制度及市場(chǎng)監(jiān)管工作的實(shí)施，需要快速、靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè)技術(shù)作為支撐。

按照檢測(cè)靶標(biāo)對(duì)象不同，可將轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)技術(shù)劃分為兩大類：一類是以轉(zhuǎn)入的外源DNA(如外源目的基因、表達(dá)調(diào)控元件、載體序列等)作為檢測(cè)對(duì)象，這類技術(shù)包括常規(guī)PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、基因芯片等；另一類是以轉(zhuǎn)入的外源目的基因或標(biāo)記基因表達(dá)的蛋白質(zhì)作為檢測(cè)對(duì)象，如ELISA、快速檢測(cè)試紙條、蛋白質(zhì)芯片等(Zhang & Guo，2011)。PCR技術(shù)由于適用性廣、靈敏度高，是目前國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)技術(shù)，根據(jù)不同原理，PCR技術(shù)又能細(xì)分為定性PCR、定量PCR、多重PCR、巢式PCR、數(shù)字PCR等(鄧漢超等，2011)。我國(guó)目前對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品實(shí)行定性標(biāo)識(shí)管理，在監(jiān)管工作中主要采用定性PCR檢測(cè)方法，已建立了針對(duì)CaMV35S啟動(dòng)子、NOS終止子等調(diào)控元件(謝家建等，2012)，針對(duì)除草劑抗性基因cp4-epsps、bar(Guoetal.,2012)、抗蟲基因Bt(李飛武等，2014)、CpTI(朱珠等，2012)等外源目的基因，以及針對(duì)MON88017玉米(瞿勇等，2010)、59122玉米(Xuetal.,2009)等轉(zhuǎn)化事件的PCR檢測(cè)方法，但未見除草劑抗性基因aad1 和dmo的PCR檢測(cè)方法的報(bào)道。

本研究以在轉(zhuǎn)基因作物中進(jìn)行商業(yè)化應(yīng)用的2種新的除草劑抗性基因aad1 和dmo為對(duì)象，開展PCR檢測(cè)體系、方法特異性、靈敏度、穩(wěn)健性等測(cè)試，旨在建立針對(duì)這2種外源目的基因的特異性PCR檢測(cè)方法，為轉(zhuǎn)基因作物的安全監(jiān)管提供切實(shí)可行的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 植物試驗(yàn)材料

轉(zhuǎn)aad1 基因玉米DAS40278-9(ERM-BF433d)、轉(zhuǎn)cp4-epsps基因玉米NK603(ERM-BF415f)、轉(zhuǎn)cry1Ab和pat基因玉米Bt11(ERM-BF412f)、轉(zhuǎn)cry34Ab、cry35Ab和pat基因玉米59122(ERM-BF424d)轉(zhuǎn)mcry3A和pmi基因玉米MIR604(ERM-BF423d)購(gòu)自歐洲標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與測(cè)量研究所(IRMM)，轉(zhuǎn)dmo基因大豆MON87708由孟山都公司研發(fā)和饋贈(zèng)，非轉(zhuǎn)基因玉米、大豆為本實(shí)驗(yàn)室收集保存的樣品。

1.2 基因組DNA提取

應(yīng)用植物基因組DNA提取試劑盒(DP320)[天根生化科技(北京)有限公司]提取樣品基因組DNA，操作步驟按試劑盒使用說明執(zhí)行，提取的DNA用ND1000核酸微量分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo Fisher)測(cè)定濃度和純度，并用試劑盒附帶的DNA稀釋緩沖液稀釋至25 ng·μL-1，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR反應(yīng)

單一PCR：在200 μL的PCR反應(yīng)管中依次加入10×PCR緩沖液2.5 μL，2.5 mmol·L-1的dNTPs混合溶液2 μL，10 μmol·L-1上下游引物各0.5 μL，5 U·μL-1熱啟動(dòng)rTaq DNA聚合酶0.125 μL，基因組DNA溶液2 μL，加超純水至25 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；35個(gè)循環(huán)(94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s)；72 ℃延伸5 min。

雙重PCR：除加入2對(duì)0.5 μL引物，并相應(yīng)調(diào)整超純水的用量至PCR體系總體積為25 μL外，其他組分的用量及PCR反應(yīng)程序與單一PCR相同。

電泳檢測(cè)：PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取 10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 除草劑抗性基因的核苷酸序列分析及引物設(shè)計(jì)與篩選

根據(jù)研發(fā)人公開的國(guó)內(nèi)外專利信息(Brinkeretal.,2013； Cuietal.,2012)，使用生物信息學(xué)軟件Vector NTI Advance?11.5進(jìn)行序列比對(duì)分析，獲得了DAS40278-9玉米中的aad1 基因(1005 bp)和MON87708大豆中的dmo基因(1275 bp)的核苷酸序列。以這2個(gè)基因的序列為模板，應(yīng)用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)了一系列PCR檢測(cè)引物，經(jīng)過試驗(yàn)驗(yàn)證確定的檢測(cè)引物相關(guān)信息見表1。為保證所設(shè)計(jì)引物序列的特異性，將設(shè)計(jì)的引物序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫(http:∥blast.st-va.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行核苷酸序列檢索，結(jié)果顯示，引物序列與主要農(nóng)作物均不具有同源性，從理論上保證了引物在轉(zhuǎn)基因作物檢測(cè)中的特異性。

表1 PCR檢測(cè)引物信息Table 1 Information of the PCR primers

2.2 單一PCR檢測(cè)方法的特異性測(cè)試

以DAS40278-9玉米、NK603玉米、Bt11玉米、59122玉米、MIR604玉米、MON87708大豆等6種轉(zhuǎn)基因作物以及非轉(zhuǎn)基因玉米和大豆為測(cè)試樣品，對(duì)aad1 基因和dmo基因的檢測(cè)方法進(jìn)行特異性測(cè)試。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖譜見圖1和圖2，在aad1 基因檢測(cè)體系中僅DAS40278-9玉米樣品出現(xiàn)特異性條帶，dmo基因檢測(cè)體系中僅MON87708大豆樣品出現(xiàn)特異性條帶，其他測(cè)試樣品和空白對(duì)照在2種檢測(cè)體系中均未出現(xiàn)特異性產(chǎn)物，表明本研究建立的2種除草劑基因的PCR檢測(cè)方法對(duì)靶標(biāo)基因具有高度特異性。

2.3 單一PCR檢測(cè)方法的靈敏度測(cè)試

提取DAS40278-9玉米的基因組DNA，用0.1×TE緩沖液對(duì)其進(jìn)行梯度稀釋，獲得質(zhì)量濃度為250、125、25、12.5、2.5 pg·μL-1的5份樣品，取2 μL作為模板，利用aad1 基因的PCR檢測(cè)方法進(jìn)行測(cè)試，以判定方法的靈敏度。采用同樣的制樣方法，獲得MON87708大豆基因組DNA質(zhì)量濃度為250、125、25、12.5、2.5 pg·μL-1的5份樣品，用于dmo基因的PCR檢測(cè)方法的靈敏度測(cè)試。結(jié)果如圖3和圖4所示，2個(gè)基因的PCR檢測(cè)方法均可以從25 pg·μL-1及以上濃度的樣品中獲得與預(yù)期大小一致的擴(kuò)增產(chǎn)物，表明本研究建立的aad1 基因和dmo基因的PCR檢測(cè)方法的檢出限均可達(dá)到50 pg，按照玉米和大豆的基因組DNA大小進(jìn)行估算(Arumuganathan & Earle，1991)，2種方法的絕對(duì)檢出限分別約為20個(gè)拷貝和40個(gè)拷貝，具有良好的靈敏度。

圖1 aad1 基因PCR檢測(cè)方法的特異性Fig.1 Specificity of PCR method for detecting aad1 gene M：DL2000 DNAMarker；1：空白對(duì)照；2：DAS40278-9；3：NK603；4：Bt11；5：59122；6：MIR604；7：MON87708；8：非轉(zhuǎn)基因玉米和大豆混樣。 M： DL2000 DNA Marker; 1： blank control; 2: DAS40278-9; 3: NK603; 4: Bt11; 5: 59122; 6: MIR604; 7: MON87708; 8: non-GM maize and soybean mix.

2.4 PCR檢測(cè)體系的穩(wěn)健性

為測(cè)試aad1 基因和dmo基因PCR檢測(cè)方法對(duì)不同退火溫度的適應(yīng)度，對(duì)每種基因的PCR檢測(cè)體系均設(shè)置56、58、60、62、64 ℃等5個(gè)退火溫度，進(jìn)行PCR方法的穩(wěn)健性測(cè)試。PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖5，2個(gè)基因的PCR檢測(cè)體系在5種退火溫度條件下，均能獲得與預(yù)期一致的PCR產(chǎn)物，表明2種基因的PCR檢測(cè)方法對(duì)退火溫度有較寬的適合度，具有良好的適用性。

圖2 dmo基因PCR檢測(cè)方法的特異性Fig.2 Specificity of PCR method for detecting dmo gene M:DL2000 DNA Marker；1：空白對(duì)照；2：MON87708；3：NK603；4：Bt11；5：59122；6：MIR604；7：DAS40278-9；8：非轉(zhuǎn)基因玉米和大豆混樣。 M： DL2000 DNA Marker; 1： blank control; 2： MON87708; 3： NK603; 4： Bt11; 5： 59122; 6： MIR604; 7： DAS40278-9; 8： non-GM maize and soybean mix.

圖3 aad1 基因PCR檢測(cè)方法的靈敏度Fig.3 Sensitivity of PCR method for detecting aad1 gene M：DL2000 DNA Marker；1：空白對(duì)照；2：非轉(zhuǎn)基因玉米和大豆混樣；3～7分別代表質(zhì)量濃度為250、125、25、12.5、2.5 pg·μL-1的DAS40278-9玉米基因組DNA樣品。 M： DL2000 DNA Marker; 1： blank control; 2： non-GM maize and soybean mix; 3～7: 250, 125, 25, 12.5 and 2.5 pg·μL-1 of DAS40278-9 maize genomic DNA, respectively.

圖4 dmo基因PCR檢測(cè)方法的靈敏度Fig.4 Sensitivity of PCR method for detecting dmo gene M：DL2000 DNA Marker；1：空白對(duì)照；2：非轉(zhuǎn)基因玉米和大豆混樣；3～7分別代表質(zhì)量濃度為 250、125、25、12.5、2.5 pg·μL-1的MON87708大豆基因組DNA樣品。 M： DL2000 DNA Marker; 1： blank control; 2： non-GM maize and soybean mix; 3～7: 250, 125, 25, 12.5 and 2.5 pg·μL-1 of MON87708 soybean genomic DNA, respectively.

圖5 PCR檢測(cè)方法的穩(wěn)健性Fig.5 Robustness of PCR method M：DL2000 DNA Marker；1：空白對(duì)照；2：非轉(zhuǎn)基因玉米和大豆混樣；3～7分別代表退火溫度為56、58、60、62、64 ℃。 M： DL2000 DNA Marker; 1： blank control; 2： non-GM maize and soybean mix; 3～7: annealing with 56, 58, 60, 62 and 64 ℃, respectively.

2.5 雙重PCR檢測(cè)體系的建立

本研究將aad1 基因和dmo基因的PCR檢測(cè)引物放到同一個(gè)反應(yīng)體系中，旨在建立能同時(shí)檢測(cè)這2個(gè)靶標(biāo)基因的雙重PCR檢測(cè)方法。將DAS40278-9玉米的基因組DNA和MON87708大豆的基因組DNA等量混合，并用0.1×TE緩沖液對(duì)混合DNA樣品進(jìn)行梯度稀釋，獲得DAS40278-9玉米基因組DNA和MON87708大豆基因組DNA的質(zhì)量濃度均為250、125、25、12.5、2.5 pg·μL-1的5份樣品，對(duì)雙重PCR檢測(cè)體系進(jìn)行測(cè)試。結(jié)果如圖6所示，利用雙重PCR檢測(cè)體系，可獲得與單一PCR檢測(cè)體系相同的檢測(cè)靈敏度，雙重PCR檢測(cè)體系中aad1 基因和dmo基因的檢出限分別可達(dá)到約20個(gè)拷貝和40個(gè)拷貝。

圖6 雙重PCR檢測(cè)方法的靈敏度Fig.6 Sensitivity of the duplex PCR for detecting aad1 and dmo gene M：DL2000 DNA Marker；1：空白對(duì)照；2：非轉(zhuǎn)基因玉米和大豆混樣；3～7分別代表質(zhì)量濃度各為250、125、25、 12.5、2.5 pg·μL-1的DAS40278-9玉米和MON87708大豆基因組DNA混樣。 M： DL2000 DNA Marker; 1： blank control; 2： non-GM maize and soybean mix; 3～7: 250, 125, 25, 12.5 and 2.5 pg·μL-1 of DAS40278-9 maize and MON87708 soybean genomic DNA mix, respectively.

3 討論

將除草劑抗性基因?qū)胱魑锖螅墒购笳邠碛锌钩輨┑奶匦?，這為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用除草劑防治雜草提供了便利(李云河等，2012)。通過查詢國(guó)內(nèi)外有關(guān)數(shù)據(jù)庫，目前在生產(chǎn)上應(yīng)用的除草劑抗性基因主要為cp4-epsps、bar、aad1、dmo等，其中cp4-epsps基因和bar基因在轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化初期就已投入應(yīng)用，是目前使用頻次最高的2類除草劑抗性基因(陳海偉等，2012)，aad1 基因和dmo基因自2011年開始在商業(yè)化轉(zhuǎn)基因作物中出現(xiàn)并已有多種轉(zhuǎn)化體進(jìn)入中國(guó)市場(chǎng)。因此，以除草劑抗性基因?yàn)榘袠?biāo)對(duì)象的特異性檢測(cè)方法是轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品日常監(jiān)管和篩選檢測(cè)的重要技術(shù)手段之一。

由于cp4-epsps基因和bar基因在轉(zhuǎn)基因作物中已被廣泛長(zhǎng)期應(yīng)用，針對(duì)這2個(gè)基因的PCR檢測(cè)方法已有諸多報(bào)道，并形成相應(yīng)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(路興波等，2012； 楊立桃等，2012)。然而，aad1 基因和dmo基因是近幾年來才被應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因作物，而且含有這2個(gè)基因的轉(zhuǎn)化體才開始向我國(guó)提交進(jìn)口申請(qǐng)，目前還未見關(guān)于aad1 基因和dmo基因的PCR檢測(cè)方法的報(bào)道。本研究通過查詢國(guó)內(nèi)外專利信息，獲得了這2個(gè)基因的核苷酸序列，并根據(jù)該序列建立了特異性檢測(cè)這2個(gè)基因的PCR檢測(cè)方法，檢出限可達(dá)到20個(gè)拷貝(aad1 )和40個(gè)拷貝(dmo)，能夠滿足日常監(jiān)管工作的需要，該方法的相關(guān)技術(shù)指標(biāo)已達(dá)到同類檢測(cè)方法的水平(Guoetal.,2012)。

在一個(gè)PCR體系中同時(shí)檢測(cè)多種轉(zhuǎn)基因成分可提高檢測(cè)效率、降低檢測(cè)成本(王渭霞等，2009)。本研究將aad1 基因和dmo基因的檢測(cè)引物放在同一個(gè)PCR反應(yīng)管中進(jìn)行檢測(cè)，建立了能在一個(gè)PCR管中同時(shí)檢測(cè)這2個(gè)目的基因的雙重PCR方法，檢測(cè)靈敏度達(dá)到與單一PCR方法相同的水平，具有較好的應(yīng)用前景。

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