雙氯芬酸鈉滴眼液有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)方法研究

★ 胡奕軍 胡奕勤

(1.撫州市第三醫(yī)院 江西 撫州 344000；2.撫州市餐飲服務(wù)監(jiān)督所 江西 撫州 344000)

雙氯芬酸鈉滴眼液臨床用于治療葡萄膜炎、角膜炎、鞏膜炎，抑制角膜新生血管的形成，治療眼內(nèi)手術(shù)后、激光濾簾成形術(shù)后或各種眼部損傷的炎癥反應(yīng)，抑制白內(nèi)障手術(shù)中縮瞳反應(yīng)；用于準(zhǔn)分子激光角膜切削術(shù)后止痛及消炎；治療春季結(jié)膜炎、季節(jié)過(guò)敏性結(jié)膜炎等過(guò)敏性眼病，預(yù)防和治療白內(nèi)障及人工晶體術(shù)后炎癥及黃斑囊樣水腫，以及青光眼濾過(guò)術(shù)后促進(jìn)濾過(guò)泡形成等。雙氯芬酸鈉滴眼液作為一種經(jīng)典非甾體抗炎制劑，其抗炎作用與地塞米松相同，無(wú)激素類(lèi)副作用，并且還能有效緩解疼痛，在國(guó)內(nèi)該品種一直按新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)[1]控制產(chǎn)品質(zhì)量。但該質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)未對(duì)有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行直接控制。為了進(jìn)一步控制該產(chǎn)品的質(zhì)量，我們建立了雙氯芬酸鈉滴眼液有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)方法。在該色譜系統(tǒng)中雙氯芬酸鈉滴眼液的有關(guān)物質(zhì)二氯苯基吲哚酮、雙氯芬醇、雙氯芬醛和其他雜質(zhì)均能較好分離，通過(guò)在溶劑峰后扣除抑菌劑色譜峰，并控制完成檢測(cè)的時(shí)間，即能有效控制產(chǎn)品質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent1100高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)，AEG-45SM半微量電子分析天平(SHIMADZU)。

1.2 試藥 雙氯芬酸鈉對(duì)照品：經(jīng)105℃干燥3h，批號(hào)：100334-200302；雙氯芬酸鈉滴眼液：自制樣品，批號(hào)：110301，110302，110303；試劑：磷酸、醋酸為分析純；甲醇為色譜純，水為注射用水。

2 試驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以0.03mol/L磷酸溶液-0.2%醋酸(V/V)甲醇溶液(33∶67)為流動(dòng)相，流速為1mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為222nm,柱溫為室溫，理論塔板數(shù)按雙氯芬酸鈉計(jì)不低于3000。

2.2 溶液的制備 各單獨(dú)輔料溶液的制備：按雙氯芬酸鈉滴眼液處方中各個(gè)輔料用量分別配制各單獨(dú)輔料溶液。

完整空白輔料溶液的制備：按雙氯芬酸鈉滴眼液處方中完整輔料用量配制完整空白輔料溶液。

原料溶液的制備：取雙氯芬酸鈉原料適量，加水稀釋成每1mL中約含雙氯芬酸鈉1mg的溶液作為原料溶液。

2.3 測(cè)定法 精密量取樣品3mL，置25mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液；精密量取供試品溶液1mL，置100mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照溶液A；精密稱(chēng)取苯扎氯銨適量，加水制成0.01%的溶液，精密量取3mL，置25mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照溶液B。取對(duì)照溶液A 20μL注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度，使主成分峰的峰高約為滿量程的10%；另取對(duì)照溶液B、供試品溶液20μL分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主峰保留時(shí)間的2倍，供試品溶液色譜圖中如在溶劑峰后出現(xiàn)雜質(zhì)峰，應(yīng)扣除苯扎氯銨峰。(注：供試品溶液應(yīng)在2h內(nèi)完成測(cè)定)

2.4 方法學(xué)研究

2.4.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 用樣品在220～800nm的范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，可知其在220～336nm均有吸收。為了優(yōu)化有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)波長(zhǎng)，參照雙氯芬酸鈉滴眼液新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)[1]中的含量測(cè)定波長(zhǎng)、溶液顏色檢測(cè)波長(zhǎng)和有關(guān)文獻(xiàn)的色譜條件，分別在222nm、254nm、276nm、420nm對(duì)輔料溶液和樣品溶液的供試品溶液進(jìn)樣檢測(cè)，結(jié)果樣品在276nm和420nm均未檢出有關(guān)物質(zhì)；樣品在222nm、254nm均檢出有關(guān)物質(zhì)，分別按面積歸一化法計(jì)算其有關(guān)物質(zhì)含量依次為0.927%、0.806%，即在222nm檢出的有關(guān)物質(zhì)的含量明顯大于254nm檢出的有關(guān)物質(zhì)的含量，且有關(guān)物質(zhì)檢出的個(gè)數(shù)也更多。參照慶大霉素雙氯芬酸鈉滴眼液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[2]選擇222nm為有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.4.2 溶劑峰和輔料峰確認(rèn)實(shí)驗(yàn)

2.4.2.1 實(shí)驗(yàn)方法 (1)分別精密量取3mL各單獨(dú)輔料溶液、完整空白輔料溶液、滴眼劑樣品(批號(hào)：110303)，分別置25mL量瓶中。(2)分別加流動(dòng)相于上述25mL量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，作為待測(cè)液。(3)分別取流動(dòng)相、各單獨(dú)輔料溶液、完整空白輔料溶液、滴眼劑樣品的待測(cè)液20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時(shí)間的兩倍。

圖1 流動(dòng)相HPLC圖

圖2 氯化鈉溶液HPLC圖

圖3 硼酸溶液HPLC圖

圖4 硼砂溶液HPLC圖

圖5 聚山梨酯80溶液HPLC圖

圖6 依地酸二鈉溶液HPLC圖

圖7 苯扎氯按溶液HPLC圖

圖8 空白輔料溶液HPLC圖

圖9 滴眼劑樣品(立即進(jìn)樣)

圖10 滴眼劑樣品(1h后進(jìn)樣)

圖11 滴眼劑樣品(2h后進(jìn)樣)

2.4.2.2 溶劑峰和輔料峰的確認(rèn)分析 (1)溶劑峰的確認(rèn)分析。流動(dòng)相色譜圖中出現(xiàn)兩個(gè)色譜峰，保留時(shí)間分別為2.2min、5.32min；氯化鈉溶液色譜圖、硼酸溶液色譜圖、硼砂溶液色譜圖、聚山梨酯80溶液色譜圖、依地酸二鈉溶液色譜圖、苯扎氯銨溶液色譜圖、完整空白輔料溶液色譜圖、滴眼劑樣品色譜圖中均在2.2min、5.3min出現(xiàn)色譜峰，保留時(shí)間一致。因此可以確認(rèn)，在滴眼劑樣品有關(guān)物質(zhì)檢查的色譜圖中2.2min、5.3min處的色譜峰為溶劑峰，見(jiàn)圖1～圖12。(2)輔料峰的確認(rèn)分析，見(jiàn)表1。

圖12 滴眼劑樣品(3h后進(jìn)樣)

表1 各輔料峰的保留時(shí)間結(jié)果(min)

供試品溶劑峰保留時(shí)間輔料峰保留時(shí)間(相對(duì)保留時(shí)間)氯化鈉溶液5.32.2、2.6、2.9、3.2、4.1硼酸溶液5.22.9、3.4、4.1硼砂溶液5.32.2、2.9、4.1聚山梨酯80溶液5.32.9、3.5、4.1依地酸二鈉溶液5.32.6、2.8、2.9、3.4、4.1苯扎氯銨溶液5.32.2、2.9、3.4、4.1、15.0完整空白輔料溶液5.32.2、2.6、2.8、2.9、3.2、3.4、4.1、15.0滴眼劑樣品(立即進(jìn)樣)5.32.2、2.6、2.8、2.9、3.2、3.4、4.1、14.9(0.57)滴眼劑樣品(1h后進(jìn)樣)5.32.2、2.6、2.8、2.9、3.2、3.4、4.1、14.7(0.57)滴眼劑樣品(2h后進(jìn)樣)5.32.2、2.6、2.8、2.9、3.2、3.4、4.1、14.7(0.56)滴眼劑樣品(3h后進(jìn)樣)5.32.2、2.6、2.8、2.9、3.2、3.4、4.1、14.6(0.56)

綜上所述，除苯扎氯銨外其他輔料的色譜峰都在5.3min之前出峰，為了便于扣除輔料峰，可以用溶劑峰(流動(dòng)相色譜圖中最后一個(gè)色譜峰)來(lái)扣除苯扎氯銨之外的輔料峰；另外滴眼劑樣品色譜圖中苯扎氯銨的保留時(shí)間均出現(xiàn)在溶劑峰和主峰之間，故需要用苯扎氯銨溶液作為對(duì)照的方法來(lái)扣除苯扎氯銨峰。

2.4.3 專(zhuān)屬性考察

2.4.3.1 實(shí)驗(yàn)方法 (1)分別精密量取3mL原料溶液、空白輔料溶液、滴眼劑樣品各2份分別置25mL量瓶中，其中一份進(jìn)行破壞試驗(yàn)，另一份不進(jìn)行破壞以作參照。(2)分別加流動(dòng)相于上述25mL量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，作為待測(cè)液。(3)分別取空白輔料溶液、原料溶液、滴眼劑樣品溶液的待測(cè)液20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時(shí)間的兩倍。

2.4.3.2 降解產(chǎn)物色譜峰 光降解破壞條件：置紫外燈下4000LX照射24h；熱降解破壞條件：沸水浴加熱24h；氧化降解破壞條件：加入10%雙氧水2mL，放置24h；酸降解破壞條件：加入1mol/L鹽酸溶液1mL，混勻后放置24h，加入1mol/L氫氧化鈉溶液1mL中和；堿降解破壞條件：加入1mol/L氫氧化鈉1mL，混勻后放置24h，加入1mol/L鹽酸溶液1mL中和。經(jīng)試驗(yàn)證明：原料和樣品各經(jīng)劇烈條件破壞試驗(yàn)產(chǎn)生的雜質(zhì)之間、雜質(zhì)與雙氯芬酸鈉色譜峰均能有效分離，且保留時(shí)間均在主峰保留時(shí)間的2倍之內(nèi)，色譜系統(tǒng)專(zhuān)屬性較好。

2.4.4 檢測(cè)限測(cè)定 取雙氯芬酸鈉對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加流動(dòng)相溶解制成每1mL中含雙氯芬酸鈉0.0998mg的溶液，再分別稀釋成100倍、1000倍、10000倍溶液，取20μL注入液相色譜儀，測(cè)得最小檢知量0.1996ng(S/N>3，檢測(cè)溶度：9.98ng/mL)。樣品檢測(cè)的進(jìn)樣溶度為120 000ng/mL，即樣品檢測(cè)的進(jìn)樣量是最小檢知量的12 000倍，符合有關(guān)規(guī)定。

2.4.5 待測(cè)樣液的穩(wěn)定性 將上述滴眼劑樣品(批號(hào)：110303)的待測(cè)液分別在配制后立即進(jìn)樣、1h后進(jìn)樣、2h后進(jìn)樣、3h后進(jìn)樣檢測(cè)有關(guān)物質(zhì)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 待測(cè)樣液的穩(wěn)定性結(jié)果(min)

綜上所述，待測(cè)樣液在2h內(nèi)測(cè)定，色譜圖出現(xiàn)兩個(gè)雜質(zhì)峰；待測(cè)樣液在2h后測(cè)定，色譜圖出現(xiàn)三個(gè)雜質(zhì)峰，即在相對(duì)保留時(shí)間1.9倍處多出現(xiàn)一雜質(zhì)峰，提示待測(cè)樣液在2h內(nèi)穩(wěn)定，因此待測(cè)樣液應(yīng)在2h內(nèi)完成測(cè)定。這可能與流動(dòng)相的PH值有關(guān)，因?yàn)殡p氯芬酸鈉在酸性條件下不太穩(wěn)定。

表3 三批樣品有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果

2.5 樣品的有關(guān)物質(zhì)測(cè)定 根據(jù)上述確定的方法，對(duì)三批樣品進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討論

3.1 應(yīng)將流動(dòng)相色譜圖中最后一個(gè)色譜峰確認(rèn)為溶劑峰 由于流動(dòng)相中有機(jī)相比例較高，在進(jìn)流動(dòng)相確認(rèn)溶劑峰時(shí)要做到進(jìn)的流動(dòng)相與色譜系統(tǒng)中的流動(dòng)相完全一致，否則由于流動(dòng)相中有機(jī)相的揮發(fā)會(huì)導(dǎo)致流動(dòng)相中水相比例相對(duì)增高，從而導(dǎo)致流動(dòng)相色譜圖中出現(xiàn)兩個(gè)色譜峰，保留時(shí)間分別為2.976min、5.326min。同時(shí)由于氯化鈉溶液、硼酸溶液、硼砂溶液、聚山梨酯80溶液、依地酸二鈉溶液、苯扎氯銨溶液、完整空白輔料溶液、滴眼劑樣品的待測(cè)液中的溶劑與流動(dòng)相相比并不是完全一致，水相比例相對(duì)增高，因此其均在2.9min和5.3min出現(xiàn)色譜峰。考慮各地水質(zhì)差異和有關(guān)輔料(除苯扎氯銨外)的色譜峰都在5.3min之前出峰，為了便于扣除輔料峰，應(yīng)將流動(dòng)相色譜圖中最后一個(gè)色譜峰確認(rèn)為溶劑峰。

3.2 與有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)方法的比較 有關(guān)文獻(xiàn)[2]中只是簡(jiǎn)單的控制二氯苯基吲哚酮、雙氯芬醇、雙氯芬醛這3個(gè)已知雜質(zhì)的量，既沒(méi)有考慮到抑菌劑可能對(duì)有關(guān)物質(zhì)檢查的干擾，也沒(méi)有對(duì)可能產(chǎn)生的其他有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行控制，同時(shí)對(duì)待測(cè)樣液的穩(wěn)定性的考察有明顯的不足，即該方法不能有效地控制產(chǎn)品的有關(guān)物質(zhì)。本有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)方法，通過(guò)增加抑菌劑對(duì)照的辦法解決了抑菌劑對(duì)有關(guān)物質(zhì)檢查的干擾；按照國(guó)內(nèi)外有關(guān)物質(zhì)研究指導(dǎo)原則的要求，通過(guò)控制其他雜質(zhì)不得超過(guò)0.1%，有效地提高了該滴眼液的安全性；通過(guò)控制完成檢測(cè)的時(shí)間，避免了對(duì)產(chǎn)品有關(guān)物質(zhì)的誤檢出和誤判。

總之，采用本高效液相色譜法，通過(guò)檢測(cè)波長(zhǎng)、溶劑峰和輔料峰確認(rèn)、專(zhuān)屬性、檢測(cè)限、待測(cè)樣液的穩(wěn)定性等研究，證明本方法切實(shí)可行，可用于雙氯芬酸鈉滴眼液有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì)編.新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn).第30冊(cè)：134，標(biāo)準(zhǔn)號(hào)：WS1-(X-059)-2002Z.

[2]國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局.慶大霉素雙氯芬酸鈉滴眼液注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)，標(biāo)準(zhǔn)號(hào):YBH03812007.