紅腺忍冬葉抗氧化有效部位多糖的含量變化研究*

★ 施思 郭鑫 朱英

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 浙江 杭州 310053)

紅腺忍冬LonicerahypoglaucaMiq.為忍冬科忍冬屬藤本類植物，又名菰腺忍冬、盤腺忍冬、腺背金銀花等[1]，為中藥山銀花的植物來源之一，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱之效。藥典規(guī)定其藥用部位為干燥花蕾或帶初開的花[2]，但因紅腺忍冬花期較短、采收時(shí)間有限，致使資源相對(duì)緊缺。而作為副產(chǎn)品的葉子，雖產(chǎn)量較高，但因?yàn)榉撬幱貌课欢鈼売?。紅腺忍冬分布廣泛，浙江為其主產(chǎn)區(qū)之一[3,4]，植物原料資源豐富。故研究開發(fā)紅腺忍冬葉的有效成分及藥用價(jià)值有利于有效利用地方植物資源，具有深遠(yuǎn)的現(xiàn)實(shí)意義。本實(shí)驗(yàn)室前期已對(duì)浙江產(chǎn)紅腺忍冬葉的藥理作用進(jìn)行了初步研究[5]，結(jié)果表明紅腺忍冬葉水提液具有較優(yōu)的抗氧化作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，紅腺忍冬葉水提液的30%乙醇沉淀物及濾液也具有抗氧化作用，且30%乙醇沉淀物的抗氧化效果強(qiáng)于其它分級(jí)醇沉所得的沉淀物和濾液。有報(bào)道表明植物多糖及其復(fù)合物具有良好的抗氧化作用[6-8]，參照相關(guān)文獻(xiàn)[9,10]擬建立紅腺忍冬葉提取液中多糖含量測(cè)定方法，并對(duì)紅腺忍冬葉抗氧化有效部位(水提液、水提液的30%乙醇沉淀物及其濾液)中的多糖含量進(jìn)行測(cè)定和比較，為確定紅腺忍冬葉抗氧化有效成分提供幫助。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 UV-2800H型可見-紫外分光光度計(jì)(尤尼柯(上海)儀器有限公司)；METTLER AL104電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；HH-S型恒溫水浴鍋(鞏義市英峪予華儀器廠)；CD-100L華迪超聲熱風(fēng)干燥箱(浙江省新昌暖通設(shè)備廠)；SHZ-D(III)循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)；0.5～10μL和10～100μL型移液器(大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器(北京)有限公司)。

1.2 試藥 紅腺忍冬葉S1-S15批，2011年～2013年采集于浙江省，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物教研室陳錫林副教授鑒定為忍冬科植物紅腺忍冬LonicerahypoglaucaMiq.的葉子；D-無水葡萄糖對(duì)照品(中國食品藥品鑒定研究院，批號(hào)：110833-201205)；其他試劑均為分析純；水為蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 葡萄糖對(duì)照品溶液的制備 精密稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖對(duì)照品適量，加蒸餾水溶解并定容，得濃度為1.0mg/mL和0.1mg/mL的葡萄糖對(duì)照品溶液，放入冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 供試品溶液的制備 精密稱取50～60℃干燥至恒重的藥材10g，石油醚脫脂2次，每次24h，棄去石油醚，將藥材揮至無石油醚味，加12倍量蒸餾水，煎煮2次，每次微沸1h(保持水位)，趁熱過濾，合并濾液，濃縮至100mL。將所得水提濃縮液平均分成兩等份。一份作為紅腺忍冬葉水提液供試品(No.1)供含量測(cè)定用，一份用于30%乙醇沉淀。

將用于醇沉的水提濃縮液，加無水乙醇適量至溶液含醇度為30%。加醇時(shí)應(yīng)不斷用玻璃棒攪拌，以避免局部醇濃度過高。靜置過夜，3000r/min離心10min，分離濾液和沉淀，得30%乙醇直接沉淀物和濾液。濾液回收溶劑，得浸膏；沉淀低溫干燥。將濾液浸膏和干燥沉淀分別置于50mL容量瓶中，加蒸餾水溶解并定容至刻度，搖勻，得30%乙醇沉淀后濾液供試品溶液(No.2)和沉淀供試品溶液(No.3)。

No.1、No.2、No.3均相當(dāng)于藥材濃度為0.1g/mL。

2.3 5%苯酚溶液的配制 精密稱取苯酚100g，加0.10g鋁片和碳酸氫鈉0.05g，蒸餾，收集182℃餾分。稱取該餾分5.0g，置于100mL容量瓶中，加蒸餾水溶解并定容至刻度，搖勻，得5%苯酚溶液，移至棕色試劑瓶，備用。

2.4 DNS試劑的配制 將3,5-二硝基水楊酸(DNS)6.3g和2mol/L氫氧化鈉262mL，加到500mL含有182g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，再加入5g重苯酚和5g亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻后轉(zhuǎn)置1 L容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，搖勻，得DNS試劑，移至棕色試劑瓶中放置1周后使用。

2.5 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

2.5.1 總糖測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 按總糖測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下，對(duì)葡萄糖對(duì)照品溶液與供試品溶液分別進(jìn)行顯色，并在400～600nm范圍內(nèi)掃描，結(jié)果如圖1。由圖可知苯酚-濃硫酸顯色試劑本身對(duì)顯色體系的影響很小，可忽略，故選擇485nm處為總糖最佳測(cè)定波長(zhǎng)。

圖1 總糖顯色掃描圖譜示意圖

2.5.2 還原糖測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 按還原糖測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下，對(duì)葡萄糖對(duì)照品溶液與供試品溶液分別進(jìn)行顯色，并在400～600nm范圍內(nèi)掃描，結(jié)果如圖2。由圖可知，DNS試劑本身即有較強(qiáng)的吸收，且因在顯色過程中DNS試劑的消耗量不定導(dǎo)致其對(duì)顯色體系的干擾無法明確判定。綜合考慮并參考相關(guān)文獻(xiàn)[11]后選擇550nm為還原糖最佳測(cè)定波長(zhǎng)較以消除DNS試劑的干擾。

圖2 還原糖顯色掃描圖譜示意圖

2.6 顯色條件的優(yōu)化 分別對(duì)苯酚-硫酸顯色法、DNS顯色法顯色相關(guān)因素進(jìn)行單因素考察，以確定較優(yōu)顯色條件。結(jié)果如圖3、4所示，綜合考慮得，苯酚-硫酸顯色法較優(yōu)顯色條件應(yīng)為：5%苯酚用量為1mL、濃硫酸用量為7mL、顯色溫度為100℃、顯色時(shí)間為10min；DNS顯色法較優(yōu)顯色條件應(yīng)為：DNS試劑用量為1.5mL、顯色溫度為100℃、顯色時(shí)間為10min。

圖3 苯酚-硫酸顯色法顯色考察

圖4 DNS顯色法顯色考察

2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

2.7.1 總糖測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密吸取0.1mg/mL葡萄糖對(duì)照品溶液0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2,1.4mL，分別置于7支干燥的10mL容量瓶中，加蒸餾水至2mL，混勻，加1.0mL 5%苯酚溶液，搖勻，迅速加入7mL濃硫酸，置沸水中水浴10min，以流水冷卻至室溫，以空白管為對(duì)照，測(cè)定485nm波長(zhǎng)處的吸光度。以葡萄糖顯色濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程為A=58.857C-0.0054(r=0.9997)，葡萄糖濃度為0.002～0.014mg/mL時(shí)顯色線性關(guān)系良好。

2.7.2 還原糖測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密吸取1.0mg/mL葡萄糖對(duì)照品溶液0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2,1.4mL，分別置于7支干燥的10mL容量瓶中，加1.5mL DNS試劑，加蒸餾水定容至刻度，搖勻后置沸水中浴10min，以流水冷卻至室溫，以空白管為對(duì)照，測(cè)定550nm波長(zhǎng)處的吸光度。以葡萄糖顯色濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程為A=5.371C-0.0524(r=0.9996)，葡萄糖濃度為0.02～0.14mg/mL時(shí)顯色線性關(guān)系良好。

2.8 方法學(xué)考察

2.8.1 精密度考察 精密吸取S9批藥材水提液供試品溶液(No.1)0.01mL，按2.7.1項(xiàng)下操作顯色，連續(xù)測(cè)定6次，得總糖測(cè)定的精密度RSD為0.13%。精密吸取S9批水提液供試品溶液(No.1)0.5mL，按2.7.2項(xiàng)下操作顯色，連續(xù)測(cè)定6次，得還原糖測(cè)定的精密度RSD為0.07%。

表1 不同批次紅腺忍冬葉抗氧化有效部位中總糖、還原糖及多糖含量(mg·mL-1，n=3)

2.8.2 穩(wěn)定性考察 精密吸取S9批藥材水提液供試品溶液(No.1)0.01mL、0.5mL各1份，分別按2.7.1及2.7.2項(xiàng)下操作顯色，并于顯色后0,20,40,60,90,120min測(cè)定吸光度，得總糖測(cè)定和還原糖測(cè)定的穩(wěn)定性RSD分別為0.75%和1.06%，表明供試品在顯色后2h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8.3 重復(fù)性考察 精密稱取S9批藥材10.0g 6份，按2.2項(xiàng)下制備水提液供試品溶液(No.1)。各取0.01mL按2.7.1項(xiàng)下操作顯色測(cè)定，得總糖測(cè)定的重復(fù)性RSD為1.23%；各取0.5mL按2.7.2項(xiàng)下操作顯色測(cè)定，得還原糖測(cè)定的重復(fù)性RSD為1.58%。

2.8.4 加樣回收率考察 精密稱取已知總糖和還原糖含量的S9批藥材5.0g 9份，按2.2項(xiàng)下制備水提液供試品溶液(No.1)。分成3組，每組分別加入適宜量(1∶0.8；1∶1；1∶1.2)的葡萄糖對(duì)照品，搖勻得加樣回收待測(cè)液(No.4)。取待測(cè)液0.01mL、0.5mL分別按2.7.1及2.7.2項(xiàng)下操作顯色，得總糖和還原糖的平均加樣回收率分別為98.56%、99.37%，RSD分別為1.43%、1.84%。

2.9 總糖、還原糖及多糖的含量測(cè)定 按照所建立的苯酚-硫酸聯(lián)合3,5-二硝基水楊酸法測(cè)定15批紅腺忍冬葉抗氧化有效部位(水提液、30%乙醇沉淀物及其濾液)中總糖及還原糖的含量，并計(jì)算多糖含量，結(jié)果如表1。

3 分析與討論

常用的多糖測(cè)定方法為苯酚-硫酸法，其原理是：多糖類成分在濃硫酸作用下水解生成單糖，并迅速脫水生成糖醛衍生物，該衍生物可與苯酚生成橙黃色化合物用于比色測(cè)定。但是藥材中存在的單糖、雙糖、低聚糖及其它還原性成分在該反應(yīng)過程中也會(huì)顯色形成干擾，從而影響測(cè)定的準(zhǔn)確性[12]。故本實(shí)驗(yàn)采用苯酚-硫酸法測(cè)定總糖含量，3,5-二硝基水楊酸法(DNS法)測(cè)定還原糖的含量，取兩者差值為多糖含量，以消除還原類成分對(duì)多糖含測(cè)的干擾，使測(cè)得的多糖含量更接近真實(shí)值。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：浙產(chǎn)紅腺忍冬葉水提液中多糖含量為5.045～12.348mg/mL，水提液30%乙醇沉淀后濾液中多糖含量為4.880～11.944mg/mL，水提液30%乙醇沉淀物中多糖含量為0.015～0.119mg/mL；同一批次，多糖含量均為水提液>水提液30%乙醇沉淀后濾液>水提液30%乙醇沉淀物；不同批次之間多糖含量差異較大，可能與藥材采收地區(qū)、時(shí)間不同等因素有關(guān)。植物多糖作為自然界含量最豐富的初級(jí)代謝產(chǎn)物，具有良好的抗氧化活性，且細(xì)胞毒性較低，具有良好的發(fā)展前景[13,14]。因本實(shí)驗(yàn)室前期藥理實(shí)驗(yàn)表明，紅腺忍冬葉水提液、30%乙醇沉淀物及其濾液均具有一定的抗氧化作用。由此可推測(cè)，多糖可能是紅腺忍冬葉水提液及其30%乙醇沉淀后濾液抗氧化作用的有效成分之一；且因水提液30%乙醇沉淀物比水提液及水提液30%乙醇沉淀后濾液中多糖含量低很多，故猜測(cè)紅腺忍冬葉應(yīng)還有其它抗氧化有效成分存在，有待進(jìn)一步研究。

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