恩度聯(lián)合紫杉醇熱化療對(duì)人胃癌SGC7901細(xì)胞株增殖抑制及凋亡影響

洪雷 魏素菊 劉巍 王俊艷 史健 姜達(dá) 劉鳳玲

·論著·

恩度聯(lián)合紫杉醇熱化療對(duì)人胃癌SGC7901細(xì)胞株增殖抑制及凋亡影響

洪雷 魏素菊 劉巍 王俊艷 史健 姜達(dá) 劉鳳玲

目的觀察恩度聯(lián)合紫杉醇熱化療對(duì)人胃癌SGC7901細(xì)胞株增殖抑制及凋亡的影響。方法取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)人胃癌SGC7901細(xì)胞株，分為對(duì)照組、41℃、42℃、43℃、44℃組，5組分別加入終濃度30 nmol/L、60 nmol/L、120 nmol/L、240 nmol/L、480 nmol/L紫杉醇，于水浴箱中分別水浴0.5 h、1 h、1.5 h，72 h后MTT法測(cè)定紫杉醇熱化療對(duì)SGC7901胃癌細(xì)胞株細(xì)胞抑制作用并確定最佳紫杉醇濃度及熱療溫度、熱作用時(shí)間。流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)對(duì)照組、恩度組(15 mg/L)，紫杉醇熱化療組，恩度聯(lián)合組(恩度+紫杉醇熱化療)的細(xì)胞凋亡率并進(jìn)行細(xì)胞周期分析。結(jié)果隨著紫杉醇濃度以及溫度的提高，SGC7901細(xì)胞株的抑制率逐步升高。在紫杉醇濃度480 nmol/L、43℃作用1 h條件下，SGC7901細(xì)胞株的抑制率達(dá)到70.99%，在各組最高。細(xì)胞凋亡率在對(duì)照組、恩度組、紫杉醇熱化療組以及聯(lián)合治療組分別為0.70%、1.48%、8.56%、12.97%。細(xì)胞周期分析可見與對(duì)照組相比恩度組的增殖期(S+G2/M)細(xì)胞比例由(52.5±2.1)%下降到(42.3±2.0)%(P<0.05)，紫杉醇熱化療組G2/M期細(xì)胞比例由(15.2±1.4)%上升至(32.1±2.2)%(P<0.05)。與紫杉醇熱化療組相比，恩度聯(lián)合治療組的G2/M期細(xì)胞比例由(32.1±2.2)%下降到(19.9±1.3)%，而G1期比例由(30.5±1.7)%上升到(48.1±2.4)%(P<0.05)。結(jié)論43℃熱作用1 h聯(lián)合480 nmol/L紫杉醇對(duì)人胃癌SGC7901細(xì)胞株增殖抑制作用在5組中最強(qiáng)，紫杉醇熱化療聯(lián)合恩度后能夠進(jìn)一步增加對(duì)SGC7901胃癌細(xì)胞株的抑制作用，并誘導(dǎo)其凋亡。

恩度；紫杉醇；熱化療；胃腫瘤；SGC7901細(xì)胞株

胃癌是當(dāng)今世界范圍內(nèi)發(fā)病和死亡最常見的惡性腫瘤之一。胃癌起病隱匿，確診時(shí)很多患者已屬晚期，喪失了手術(shù)治療的機(jī)會(huì)，而傳統(tǒng)化療療效有限，因此尋找行之有效的聯(lián)合治療方法一直是臨床工作的的重點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過MTT法檢測(cè)紫杉醇熱化療對(duì)人胃癌SGC7901細(xì)胞株的抑制作用，通過流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)探討恩度聯(lián)合紫杉醇熱化療對(duì)人胃癌SGC7901細(xì)胞株的影響，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 人胃癌SGC7901細(xì)胞株由河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心提供。恩度(先聲藥業(yè))，紫杉醇注射液(江蘇揚(yáng)子江藥業(yè))。DMSO(上海索萊寶生物科技有限公司)，胰蛋白酶(上海索萊寶生物科技有限公司)，胎牛血清(PAA Laboratories GmbH)，四甲基偶氮唑藍(lán)(美國(guó)SIGMA公司)。流式細(xì)胞儀(Epics-XLⅡ型 美國(guó)BC公司)，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(NEST biotechCo.,Ltd)，低溫超速離心機(jī)，紫外分光光度計(jì)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：將人胃癌SGC7901細(xì)胞株置于pH值7.2～7.4的DMEM培養(yǎng)液(終濃度為：10%胎牛血清，青霉素 100 U/ml，鏈霉素100 U/ml)中，于37%、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng)，形態(tài)良好無(wú)退化，待其鋪滿瓶壁70%～80%時(shí)以0.25%胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)，每日換液。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人胃癌SGC7901細(xì)胞株，制成5×105/ml的細(xì)胞懸液備用。

1.2.2 MTT法檢測(cè)紫杉醇聯(lián)合熱療對(duì)細(xì)胞增殖影響：按照溫度分為41℃、42℃、43℃、44℃ 4組。取已準(zhǔn)備好的人胃癌SGC7901細(xì)胞株單細(xì)胞懸液，以5×105/ml密度接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μl。標(biāo)準(zhǔn)條件培養(yǎng)過夜后，加入新的培養(yǎng)液或含實(shí)驗(yàn)藥品的培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)用紫杉醇終濃度分別為：30、60、120、240、480 nmol/L，每孔100 μl。分別于41℃、42℃、43℃、44℃水浴箱孵育0.5、1、1.5 h后，置于37℃恒溫，5%CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，于培養(yǎng)結(jié)束前4 h，各孔加入(5 mg/ml)的MTT溶液(MTT溶于磷酸鹽緩沖液)20 μl；培養(yǎng)結(jié)束后，棄上清，每孔加入DMSO 150 μl，避光震蕩10 min，于全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔光密度值(OD 492 nm)，并按公式抑制率=(對(duì)照組OD值-處理組OD值)/對(duì)照組OD值計(jì)算抑制率。每組獨(dú)立實(shí)驗(yàn)均至少重復(fù)3次。結(jié)果取平均值。

1.2.3 流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)藥物對(duì)人胃癌SGC7901細(xì)胞株凋亡的影響及細(xì)胞周期分析：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人胃癌SGC7901細(xì)胞株，按不同處理分4組：對(duì)照組、恩度組、恩度+紫杉醇+熱療(43℃，1 h)組；紫杉醇+熱療(43℃，1 h)組。其中恩度終濃度為：15 mg/L[1]，紫杉醇注射液終濃度：480 nmol/L；培養(yǎng)72 h后，將懸浮細(xì)胞收集到10 ml的離心管中，每樣本細(xì)胞數(shù)為(2～5)×106，1 000 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)液。

細(xì)胞周期分析：根據(jù)細(xì)胞活力測(cè)定結(jié)果，選擇1 μmol/L的HCPT處理細(xì)胞。收集(2～5)×106個(gè)細(xì)胞，用PBS 洗滌2次后，重懸于500 μl的PBS中，加入4℃乙醇固定12 h以上。離心除去乙醇，用PBS重懸洗滌，離心去PBS，加入碘化丙啶(PI)染色，室溫避光20 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)DNA含量和細(xì)胞周期，資料用Modfit軟件分析。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行樣，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

細(xì)胞凋亡分析：以不含EDTA的胰酶消化收集1×106個(gè)經(jīng)藥物處理的SCG7901細(xì)胞，PBS洗滌兩次后重懸于binding buffer，加入5 μl的Annexin V-FITC，混勻后再加入5 μl 的PI混勻，室溫避光反應(yīng)5～10 min，上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行樣，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，MTT結(jié)果各組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，方差齊時(shí)用最小顯著差法，方差不齊時(shí)采用非參數(shù)統(tǒng)計(jì)中的H檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT法測(cè)定紫杉醇熱化療對(duì)人胃癌SGC7901細(xì)胞株細(xì)胞活性抑制作用 在41℃、42℃、43℃、44℃，SGC7901胃癌細(xì)胞株在熱作用0.5、1、1.5 h后72 h，細(xì)胞抑制率會(huì)隨著紫杉醇濃度的增加而增加，較對(duì)照組有明顯差異(P<0.05)。紫杉醇各濃度下，在41℃、42℃、43℃，熱作用72 h后細(xì)胞增殖抑制率會(huì)隨著熱作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增高，其中熱作用1 h的抑制率最高，而在作用1.5 h出現(xiàn)抑制率下降的現(xiàn)象。44℃組各條件下，細(xì)胞增殖抑制率均較43℃組有所下降。最高抑制率出現(xiàn)在藥物濃度480 nmol/L，43℃作用1 h條件下。對(duì)紫杉醇480 nmol/L，熱作用1 h的不同溫度組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)43℃組與41℃組存在差異(P<0.05)，42℃組與41℃組存在差異(P<0.05)，其余各組間未見明顯差異(P>0.05)。但43℃組在各濃度時(shí)的細(xì)胞抑制率均優(yōu)于42℃組。因此我們選定43℃，熱作用1 h，紫杉醇濃度480 nmol/L作為進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的條件。見圖1。

2.2 FCM法檢測(cè)恩度聯(lián)合紫杉醇熱化療對(duì)人胃癌SGC7901細(xì)胞株凋亡的影響及細(xì)胞周期變化 對(duì)SGC7901胃癌細(xì)胞株分組處理72 h后，細(xì)胞凋亡率在對(duì)照組、恩度組、紫杉醇熱化療組以及聯(lián)合治療組分別為0.70%、1.48%、8.56%、12.97%。在紫杉醇熱療組以及聯(lián)合治療組可見凋亡峰。細(xì)胞周期分析可見與對(duì)照組相比恩度組的增殖期(S+G2/M)細(xì)胞比例由(52.5±2.1)%下降到(42.3±2.0)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。紫杉醇熱化療組體現(xiàn)典型G2/M期阻滯圖形，與對(duì)照組相比G2/M期細(xì)胞比例由(15.2±1.4)%上升至(32.1±2.2)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與紫杉醇熱化療組相比，恩度聯(lián)合治療組的G2/M期細(xì)胞比例由(32.1±2.2)% 下降到(19.9±1.3)%，而G1期比例由(30.5±1.7)%上升到(48.1±2.4)%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2、3。

圖1 熱作用1 h，各紫杉醇濃度下41℃、42℃、43℃組細(xì)胞增值抑制率

圖2 FCM細(xì)胞凋亡率測(cè)定

圖3 FCM細(xì)胞周期測(cè)定

3 討論

紫杉醇是循證醫(yī)學(xué)證實(shí)的胃癌一線化療藥物，在進(jìn)展期胃癌的治療中具有重要的地位。紫杉醇可以同時(shí)結(jié)合微管蛋白的α端和β端，從而使微管蛋白聚合，阻止紡錘體的形成，中止有絲分裂，抑制G2期細(xì)胞向M期轉(zhuǎn)化而達(dá)到抗腫瘤細(xì)胞的效果。熱療是通過物理加熱并作用于腫瘤一定時(shí)間來(lái)治療腫瘤的一種方法。腫瘤細(xì)胞具有熱敏感性，與正常組織細(xì)胞具有不同的熱耐受性，其中以S期細(xì)胞對(duì)熱最為敏感[2]。從作用機(jī)制上講，紫杉醇與熱療具備協(xié)同增效作用。熱療可使細(xì)胞膜通透性改變，促使藥物進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，還可以抑制紫杉醇作用后細(xì)胞對(duì) DNA損傷的修復(fù)，促進(jìn)紫杉醇誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。很多研究業(yè)已證實(shí)紫杉醇聯(lián)合熱療對(duì)于殺傷腫瘤細(xì)胞具備明顯的協(xié)同增效作用[3-5]。

41℃對(duì)癌細(xì)胞具有選擇性殺傷作用，而43℃熱作用1 h是殺傷癌細(xì)胞的有效劑量，加熱溫度控制在40.5℃～43℃使多數(shù)化療藥物的細(xì)胞毒作用達(dá)到最大[6]。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)41℃、42℃、43℃、44℃4個(gè)溫度組分別來(lái)觀察不同濃度紫杉醇熱化療對(duì)SGC9701的抑制作用。MTT結(jié)果顯示在作用1.5 h以及溫度44℃組均出現(xiàn)抑制率下降的現(xiàn)象，這與本實(shí)驗(yàn)室的另外一個(gè)熱療實(shí)驗(yàn)相符。從理論上講，雖然不同細(xì)胞對(duì)熱的敏感性存在差異，但隨著溫度增高以及熱作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞株的凋亡率應(yīng)逐步增高。另外，雖然我們知道腫瘤細(xì)胞存在熱耐受現(xiàn)象，但從理論上講也是出現(xiàn)在第二次以后加熱時(shí)。因此分析有可能原因：(1)實(shí)驗(yàn)操作問題影響結(jié)果；(2)是否存在其他熱耐受機(jī)制，即腫瘤細(xì)胞在溫?zé)徇^程中即出現(xiàn)熱耐受；(3)溫度變化對(duì)熱療與紫杉醇的協(xié)同作用的影響并非簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。我們剔除了44℃以及1.5 h數(shù)據(jù)，進(jìn)一步探討其余3個(gè)溫度組的結(jié)果。紫杉醇聯(lián)合熱療對(duì)SGC7901胃癌細(xì)胞株細(xì)胞的抑制作用有著明顯的溫度、熱作用時(shí)間以及藥物濃度依賴性。通過對(duì)比熱作用1 h，41℃、42℃、43℃下人胃癌SGC7901細(xì)胞株的抑制率，我們發(fā)現(xiàn)隨著溫度增加，同一紫杉醇濃度下，細(xì)胞抑制率有逐步增高趨勢(shì)。這一趨勢(shì)提示，熱療聯(lián)合紫杉醇對(duì)細(xì)胞株抑制作用優(yōu)于單純紫杉醇以及單純熱療，聯(lián)合方法取得了更高的細(xì)胞抑制率。另外，曲線圖也提示我們，達(dá)到同一細(xì)胞抑制率水平，我們可以通過提高熱療溫度達(dá)到減少紫杉醇濃度的目的，這為將熱療在臨床應(yīng)用中作為減毒、增效的方法提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

恩度具有抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、 遷移、 分化，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡并對(duì)抗VEGF促進(jìn)新生血管形成和增加血管通透性的作用。它毒性低，安全性高，因此是一個(gè)較為理想的聯(lián)合治療藥物。恩度是否對(duì)人胃癌SGC7901細(xì)胞株具有促進(jìn)凋亡的作用，目前因?qū)嶒?yàn)條件的差異而報(bào)道不一[1，7]。本實(shí)驗(yàn)流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)凋亡率并未發(fā)現(xiàn)恩度有明顯促進(jìn)凋亡的作用，但在細(xì)胞周期分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比恩度組細(xì)胞株增殖期(S+G2/M)細(xì)胞比例明顯下降，這說明恩度對(duì)該細(xì)胞株還是存在一定的增殖抑制的作用。從作用機(jī)制上講，恩度不屬于細(xì)胞毒性藥物，它通過抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞間接地達(dá)到抑制腫瘤的目的，雖然有些文獻(xiàn)提示它對(duì)部分腫瘤細(xì)胞有增值抑制、促進(jìn)凋亡的作用，但整體的抑制作用以及促凋亡作用均不高，因此臨床上很少單獨(dú)應(yīng)用恩度作為抗腫瘤手段。另外，恩度的半衰期較短，臨床治療中需要連續(xù)14 d持續(xù)靜脈注射且多療程治療才會(huì)達(dá)到相對(duì)好療效。因此，根據(jù)恩度的作用機(jī)制以及藥代謝動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)，也許調(diào)整給藥劑量或增加給藥頻次能提高恩度對(duì)癌細(xì)胞的抑制作用并促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。

文獻(xiàn)報(bào)道恩度與紫杉醇聯(lián)合可以提高抗腫瘤作用[8-10]，但其與紫杉醇熱化療聯(lián)合能否進(jìn)一步提高抗腫瘤作用，目前仍未有報(bào)道，因?yàn)槲覀儾⒉幻鞔_熱作用是否會(huì)影響恩度的作用。本實(shí)驗(yàn)流式細(xì)胞學(xué)細(xì)胞凋亡率分析結(jié)果提示：細(xì)胞凋亡率在對(duì)照組、恩度組、紫杉醇熱療組，以及聯(lián)合組呈現(xiàn)逐步增高趨勢(shì)，雖然恩度單藥未對(duì)SGC7901細(xì)胞株表現(xiàn)出明顯促凋亡作用，但當(dāng)其與紫杉醇熱化療聯(lián)合時(shí)，其促凋亡作用較紫杉醇熱化療組有了明顯的提高。另外，細(xì)胞周期分析提示，在恩度聯(lián)合治療組的G1/M期細(xì)胞比例明顯下降，這表明紫杉醇熱化療加入恩度后，很有可能促進(jìn)了G1/M期細(xì)胞的凋亡，恩度與紫杉醇熱化療間存在協(xié)同作用的機(jī)制，另外結(jié)果提示，熱作用下恩度可以發(fā)揮作用。

綜上所述，體外研究顯示，43℃熱作用1 h聯(lián)合480 nmol/L紫杉醇對(duì)人胃癌SGC7901細(xì)胞株增殖抑制作用在各組最強(qiáng)。恩度聯(lián)合紫杉醇熱化療能夠進(jìn)一步增加對(duì)SGC7901胃癌細(xì)胞株的抑制作用，并誘導(dǎo)其凋亡。

1 林萬(wàn)隆,倪克樑,谷曉媛.恩度對(duì)SGC-7901人胃癌細(xì)胞殺傷效應(yīng)及其機(jī)制的初探.中華腫瘤防治雜志,2009,21:1642-1645.

2 Ikeguchi M,Nakamura S,Kaibara N.Quantitative analysis of expression levels of bax,bcl-2,and survivin in cancer cells during cisplatin treatment.Oncol Rep,2002,9:1121-1126.

3 王承龍，張帥，趙素萍，等.紫杉醇聯(lián)合熱療對(duì)鼻咽癌CNE-1細(xì)胞株增殖及凋亡的影響.中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2009,6:844-848.

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Effectofendostatincombinedwiththermo-chemotherapyofpaclitaxelontheproliferationandapoptosisofhumangastriccarcinomacellstrain-SGC7901invitro

HONGLei,WEISuju,LIUWei,etal.DepartmentofOncology,TheFourthHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050011,China

ObjectiveTo observe the effect of endostatin combined with paclitaxel thermo-chemotherapy on the proliferation and apoptosis of human gastric carcinoma cell strain (SGC7901) in vitro.MethodsThe SGC7901 cell strain at logarithmic growth phase was divided into five groups: control group,41℃,42℃,43℃,44℃groups,then paclitaxel in final concentration of 30nmol/L, 60nmol/L,120nmol/L,240nmol/L, 480nmol/L was added into different groups, respectively.The cells in different groups were maintained in water bath for 0.5h,1h,1.5h,72h.The MTT method was used to observe the inhibitory effect of paclitaxel thermo-chemotherapy on SGC7901 cell strain and to determine the optimal conditions including concentration of paclitaxel, temperature for thermotherapy and heating time. The apoptosis rate and the change of cell cycle in control group, endostatin group (15mg/L), paclitaxel thermo-chemotherapy group and combination treatment group (endostatin+paclitaxel thermo-chemotherapy) were detected by FCM.ResultsWith the increase of paclitaxel final concentration and temperature,the inhibitory rate of SGC7901cell strain was increasing gradually,which reached 70.99% in the final concentration of paclitaxel 480nmol/L for 1-hour water bath under 43℃,which was the highest among the groups. The cell apoptosis rates in control group, endostatin group, paclitaxel thermo-chemotherapy group and combination treatment group were 0.70%, 1.48%, 8.56%, 12.97%,respectively. The cell cycle analysis showed that the cell ratio at proliferative phase (S+G2/M) in endostatin group was decreased from (52.5±2.1)% to(42.3±2.0)%,as compared with that in control group (P<0.05), however,which in paclitaxel thermo-chemotherapy group at G2/M phase was increased from (15.2±1.4)% to (32.1±2.2)% (P<0.05). As compared with that in paclitaxel thermo-chemotherapy group,the cell ratio at G2/M phase in combination treatment group was decreased from(32.1±2.2)% to (19.9±1.3)%,however,which at G1 phase was increased from (30.5±1.7)% to(48.1±2.4)%(P<0.05).ConclusionThe inhibitory effect of thermo-chemotherapy for 1 hour combined with paclitaxel in final concentration of 480nmol/L on SGC7901 cell strain proliferation is the most powerful among groups,and paclitaxel thermo-chemotherapy combined with endostatin can enhance further the effect and can induce cell apoptosis of SGC7901 cell strain.

endostatin;paclitaxel;thermo-chemotherapy;gastric carcinoma;SGC7901 cell strain

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.08.002

050011 石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院腫瘤內(nèi)科

R 735.2

A

1002-7386(2014)08-1128-04

2013-12-18)