V-ATPase在結(jié)腸癌中的表達及其臨床意義

， ，，，，， ，

(1.上海交通大學附屬第一人民醫(yī)院普外科，上海200080；2.安徽理工大學醫(yī)學院臨床外科應(yīng)用解剖學教研室，安徽 淮南232001)

結(jié)腸癌是臨床上常見的惡性腫瘤，近年來發(fā)病趨勢不斷上升，上海地區(qū)結(jié)腸癌發(fā)病率已高居全部惡性腫瘤的第2位，僅次于肺癌，死亡率位于第三位[1]。目前，結(jié)腸癌手術(shù)治療技術(shù)成熟，術(shù)后能進行規(guī)范性化療。但是患者5年總體生存率僅達到50%～55%，生存率并沒有明顯提高，其主要原因是缺少判斷預后和預測化療耐藥的靈敏指標，這也是制約目前臨床診治的核心問題[2]。因此，探尋并應(yīng)用新型預測腫瘤復發(fā)與化療敏感性的分子指標是臨床亟待解決的問題[3]。V-ATPase是一種廣泛存在于真核細胞的胞質(zhì)膜及細胞管泡膜系統(tǒng)中的H+泵[4]。新發(fā)現(xiàn)V-ATPase基因在

非小細胞肺癌[5]和食管鱗狀細胞癌中高表達，而且與化療耐藥高度相關(guān)[5-6]，但是，國內(nèi)外對V-ATPase基因在結(jié)腸癌中表達及其意義報道尚少。因此，為了提高結(jié)腸癌的術(shù)后的治愈率和生存率，本研究通過分析V-ATPase基因在結(jié)腸癌中的表達及其與臨床病理特征關(guān)系，探討V-ATPase基因?qū)Y(jié)腸癌生物學的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集上海交通大學附屬第一人民醫(yī)院胃腸外科標本庫的68例結(jié)腸癌患者腫瘤標本及患者對應(yīng)的正常組織樣本。其中男29例，女39例，患者平均年齡64.22歲。全部為結(jié)腸腺癌,其中升結(jié)腸癌23例，橫結(jié)腸癌8例，降結(jié)腸癌37例。按美國癌癥聯(lián)合會(AJCC)對結(jié)腸癌分期，Ⅰ期5例，Ⅱ期19例，Ⅲ期35例，Ⅳ期者9例。病理檢查顯示高分化者40例，中等分化者26例，低分化者2例。發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者8例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者60例；有遠處轉(zhuǎn)移者14例，無遠處轉(zhuǎn)移者54例。術(shù)中發(fā)現(xiàn)脈管浸潤者13例，其余55例無脈管浸潤。

1.2 方法

1.2.1 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)及熒光定量聚合酶鏈反(qPCR)檢測 隨機選取20對新鮮冰凍組織，應(yīng)用Trizol(Invitrogen公司，美國)提取總RNA，然后采用cDNA合成試劑盒(Thermo公司，美國)根據(jù)使用說明反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。最后使用熒光定量檢測試劑盒(Thermo公司，美國)，在Eppendoff公司生產(chǎn)的PCR儀上進行Real-time PCR擴增反應(yīng)。反應(yīng)中使用的引物序列為：①V-ATPase上游引物序列5’-ATGGCCATGGAGATAGACAGC-3’；②V-ATPase下游引物序列5’-CCATGGCTGCAAAGACGATG-3’；③GAPDH上游引物序列5’-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3’；④GAPDH下游引物序列5’-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’。QPCR反應(yīng)條件為：起始變性95 ℃時間10 min，45個循環(huán)(變性95 ℃時間10 s、退火60 ℃時間30 s、延伸72 ℃時間30 s)。每種實驗至少重復3次。V-ATPase變化的2-ΔΔCt用于表示V-ATPase基因的表達量，V-ATPase在結(jié)腸腫瘤組織相對配對正常組織中的表達計算公示為：V-ATPase△Ct=(Avg．V-ATPase_Ct-Avg．GAPDH_Ct);V-ATPase△△Ct=(V-ATPase△Ct_tumor-V-ATPase△Ct_non-tumor)。

1.2.2 免疫組織化學方法檢測 從標本庫中提取本實驗隨機選取的68對組織樣本制作的石蠟切塊，并制備厚度為4 μm的切片。然后采用兩步法進行免疫組化染色實驗，經(jīng)過脫蠟、尿素消化、3%H2O2封閉和微波修復等步驟后，一抗孵育并4 ℃過夜；次日復溫后，抗兔二抗( EnVision)37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3次，每次沖洗10 min，顯微鏡下加DAB(1∶40)顯色。經(jīng)蘇木素復染、鹽酸乙醇化、脫水和中性樹膠封片，并在室溫風干后光鏡下觀察。根據(jù)V-ATPase染色強度進行評分，分為：3分(強陽性)、2分(中等陽性)、1分(弱陽性)、0分(陰性)；根據(jù)V-ATPase染色陽性面積評分，分為3分(51～100%)、2分(10～50%)、1分(小于10%)、0分(0)。按照我們前期病理評分標準，V-ATPase免疫組化染色總評分為V-ATPase染色免疫染色強度與染色面積評分和[7]：(5～6)分，強陽性；(3～4)分，弱陽性；(0～2)分，陰性。

1.3 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 19．0軟件進行分析，采用χ2檢驗或者Fisher’S確切概率法檢驗。所有比較均為雙側(cè)檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 V-ATPase基因在結(jié)腸癌組織及配對正常組織中 的表達

20對新鮮冰凍組織中V-ATPase mRNA的平均相對表達量分別為(5.37±0.44)和(2.03±0.35)，對特異性PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果驗證了此結(jié)果，P<0.01，差異有統(tǒng)計學意義，見圖1。免疫組化染色顯示，68例患者腫瘤組織中V-ATPase基因陽性表達者47例(69.1%)，而配對正常腫瘤組織中陽性表達者僅有4例(5.8%)，兩組間差異顯著，而且V-ATPase陽性表達主要出現(xiàn)在腫瘤組織的胞膜和胞質(zhì)中。

2.2 V-ATPase基因表達與結(jié)腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

V-ATPase基因的高度表達與結(jié)腸癌患者的T分期(P<0.001)、局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.044)、腫瘤遠處轉(zhuǎn)移(P=0.049)、AJCC分期(P=0.012)、脈管浸潤(P=0.044)以及腫瘤分化程度(P<0.001)有關(guān)；但對結(jié)腸癌患者的年齡(P=0.342)、性別(P=0.981)和腫瘤發(fā)生部位(P=0.393)的影響無統(tǒng)計學意義。Ⅰ～Ⅱ期患者中，V-ATPase陽性表達者為50%(12/24)，Ⅲ～Ⅳ期患者中陽性表率高達79.5%(35/44)。免疫組化實驗結(jié)果還顯示V-ATPase基因在正常組織中不表達或者低表達，進一步證明qPCR檢測結(jié)果，見表1、圖2。這些結(jié)果同樣提示了V-ATPase基因可能參與了結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移和浸潤。

表1 V-ATPase表達與結(jié)腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系

T：腫瘤組織；N：配對正常黏膜組織

a:正常黏膜組織(陰性)；b:腫瘤組織(陰性)；c:腫瘤組織(弱陽性)；d:腫瘤組織(強陽性)

圖2V-ATPase在結(jié)腸癌組織中免疫組化EnVinsion法染色(×200)

3 討論

V-ATPase廣泛存在真核生物胞質(zhì)膜及細胞管泡膜系統(tǒng)中，編碼一種能主動轉(zhuǎn)運H+的蛋白。正常情況下V-ATPase蛋白由跨膜的V0亞基和胞質(zhì)內(nèi)的V1亞基組成，兩種亞基聚合時，能利用分解ATP產(chǎn)生的能量逆濃度梯度轉(zhuǎn)運H+，從而維持細胞內(nèi)外在一個相對穩(wěn)定的pH值[4]。在腫瘤細胞中V-ATPase常常過表達，這樣不但能抑制細胞內(nèi)酸化對抗細胞凋亡，而且胞外高濃度H+可以改變蛋白水解酶的活性，增強細胞外基質(zhì)的分解，進而影響了腫瘤細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學行為[8]。

本文研究結(jié)果顯示，69.1%結(jié)腸癌組織中V-ATPase顯示高表達，而配對的正常組織中僅有5.8%的陽性表達率。不論是在mRNA水平還是在蛋白水平，V-ATPase在結(jié)腸癌組織中表達均顯著高于配對正常組織，說明V-ATPase過表達同時發(fā)生在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平。通過分析V-ATPase表達與結(jié)腸癌臨床病理特征的關(guān)系，進一步揭示了V-ATPase與結(jié)腸癌臨床分期、局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處臟器轉(zhuǎn)移、脈管浸潤及腫瘤組織的分化程度顯著相關(guān)，而與患者年齡、性別和腫瘤發(fā)生部位則無明顯相關(guān)性。從而提示結(jié)腸癌中V-ATPase過表達很有可能參與了腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移。另外，我們還發(fā)現(xiàn)隨著腫瘤分期的提高，結(jié)腸癌中V-ATPase的陽性表達率也也明顯升高(Ⅰ～Ⅱ期為50%；Ⅲ～Ⅳ期為79.5%)，這表明結(jié)腸癌分期越晚，V-ATPase的陽性表達率越高，也說明V-ATPase的過表達與結(jié)腸癌的發(fā)展呈正相關(guān)。有文獻報道，V-ATPase的過表達后能促進MMP(matrix metalloproteinases)分泌，增強腫瘤細胞的侵襲能力，而抑制V-ATPase后，腫瘤細胞的侵襲力大大減弱[8-9]。近來，也有許多研究表明，V-ATPase參與了黑色素瘤、乳腺癌和肝癌的侵襲生長和轉(zhuǎn)移[9-12]，并且與非小細胞肺癌和食管鱗癌的浸潤以及化療耐藥有關(guān)[5-6]。從而提示V-ATPase在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展中也有重要作用，可能成為結(jié)腸癌術(shù)后預后判斷的重要分子標記物和化療預測的靈敏指標。

V-ATPase過表達與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和化療耐藥關(guān)系密切，我們也發(fā)現(xiàn)V-ATPase過表達對結(jié)腸癌生物學行為有顯著影響，但目前V-ATPase對結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展及結(jié)腸癌化療耐藥影響的具體機制仍不明確。因此，我們需要進一步探討V-ATPase對結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展生物學的作用，尋找新的結(jié)腸癌診療靶點，全面提高結(jié)腸癌患者的診治效果。

[參考文獻]

[1] 趙森林，孟 鑌，嚴東旺，等.Bmi-1基因與大腸癌術(shù)后相關(guān)性研究進展[J].局解手術(shù)學雜志，2013，22(13)：306-308.

[2] Graham JS，Cassidy J.Adjuvant therapy in colon cancer[J].Expert Rev Anticancer Ther，2012，12(1)：99-109.

[3] Zhang JX，Song W，Chen ZH，et al.Prognostic and predictive value of a microRNA signature in stage II colon cancer: a microRNA expression analysis[J].Lancet Oncol，2013，14(13)：1295-1306.

[4] Nishi T，F(xiàn)orgac M.The vacuolar (H+)-ATPases--nature’s most versatile proton pumps[J].Nat Rev Mol Cell Biol，2002，3(2)：94-103.

[5] Lu Q，Lu S，Huang L，et al.The expression of V-ATPase is associated with drug resistance and pathology of non-small-cell lung cancer[J].Diagn Pathol，2013，8(1)：145-152.

[6] Huang L，Lu Q， Han Y，et al.ABCG2/V-ATPase was associated with the drug resistance and tumor metastasis of esophageal squamous cancer cells[J].Diagn Pathol，2012，17(7)：180-187.

[7] Yan DW，Li DW，Yang YX，et al.Ubiquitin D is correlated with colon cancer progression and predicts recurrence for stage Ⅱ～Ⅲ disease after curative surgery[J].Br J Cancer，2010，103(7)：961-969.

[8] Kubota S，Seyama Y.Overexpression of vacuolar ATPase 16-kD subunit in 10T1/2 fibroblasts enhances invasion with concomitant induction of matrix metalloproteinase-2[J].Biochem Biophys Res Commun， 2000， 278(2)：390-394.

[9] Creemers LB， Jansen ID， Hoeben KA， et al.Involvement of V-ATPases in the digestion of soft connective tissue collagen[J].Biochem Biophys Res Commun，1998，251(2)：429-436.

[10] Nishisho T，Hata K，Nakanishi M，et al.The a3 isoform vacuolar type H(+)-ATPase promotes distant metastasis in the mouse B16 melanoma cells[J].Mol Cancer Res，2011，9(7)：845-855.

[11] Hendrix A，Sormunen R， Westbroek W， et al.V-ATPase expression and activity is required for Rab27B-dependent invasive growth and metastasis of breast cancer[J].Int J Cancer，2013，133(4):843-845.

[12] Straud S，Zubovych I，De Brabander JK，et al.Inhibition of iron uptake is responsible for differential sensitivity to V-ATPase inhibitors in several cancer cell lines [J].PLoS One，2010，5(7)：e11629.